探討益生素檢測(cè)方法

　　近年來，隨著對(duì)環(huán)保要求的提高，對(duì)抗生素使用的限制，以微生態(tài)為主的新一代產(chǎn)品發(fā)展迅猛，并正在形成產(chǎn)業(yè)。

　　但目前市場(chǎng)上很多益生素產(chǎn)品質(zhì)量仍不穩(wěn)定，生產(chǎn)處于復(fù)配、仿制階段，檢測(cè)手段不夠完善，產(chǎn)品的標(biāo)準(zhǔn)和檢測(cè)方法尚混亂，優(yōu)秀的檢測(cè)人員不足，造成市場(chǎng)上益生素產(chǎn)品良莠難辯。因此，我們?cè)诖藢?duì)益生菌的檢測(cè)方法作一簡(jiǎn)單探討，以期能更好的完善益生素的市場(chǎng)。

　　通過測(cè)定一定體積培養(yǎng)液中所含菌絲的量來反映微生物的生長(zhǎng)狀況。方法是，取一定量的待測(cè)培養(yǎng)液（如10mL）放在有刻度的離心管中，設(shè)定一定的離心時(shí)間（如5min）和轉(zhuǎn)速（如5000 rpm），離心后，倒出上清夜，測(cè)出上清夜體積為v，則菌絲濃度為（10-v）/10。菌絲濃度測(cè)定法是大規(guī)模工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)上微生物生長(zhǎng)的一個(gè)重要監(jiān)測(cè)指標(biāo)。這種方法比較粗放、簡(jiǎn)便、快速，但需要設(shè)定一致的處理?xiàng)l件，否則偏差很大，由于離心沉淀物中夾雜有一些固體營(yíng)養(yǎng)物，結(jié)果會(huì)有一定偏差。

　　可用離心或過濾法測(cè)定。一般干重為濕重的10-20%。在離心法中，將一定體積待測(cè)培養(yǎng)液倒入離心管中，設(shè)定一定的離心時(shí)間和轉(zhuǎn)速，進(jìn)行離心，并用清水離心洗滌1-5次，進(jìn)行干燥。干燥可用烘箱在105℃或100℃下烘干，或采用紅外線烘干。如用過濾法，絲狀真菌可用濾紙過濾，細(xì)菌可用醋酸纖維膜等濾膜過濾，過濾后用少量水洗滌，在 400℃下進(jìn)行真空干燥。稱干重法較為煩瑣，通常獲取的微生物產(chǎn)品為菌體時(shí)，常采用這種方法，如活性干酵母（activity dry yeast，ADY）。

　　微生物的生長(zhǎng)引起培養(yǎng)物混濁度的增高。通過紫外分光光度計(jì)測(cè)定一定波長(zhǎng)下的吸光值，判斷微生物的生長(zhǎng)狀況。對(duì)某一培養(yǎng)物內(nèi)的菌體生長(zhǎng)作定時(shí)跟蹤時(shí)，可采用一種特制的有側(cè)臂的三角燒瓶。將側(cè)臂插入光電比色計(jì)的比色座孔中，即可隨時(shí)測(cè)定其生長(zhǎng)情況，而不必取菌液。該法主要用于發(fā)酵工業(yè)菌體生長(zhǎng)監(jiān)測(cè)。如我所使用UNICO公司的紫外-可見分光光度計(jì)，在波長(zhǎng)600nm處用比色管定時(shí)測(cè)定發(fā)酵液的吸光光度值OD600。

　　1.4 血球計(jì)數(shù)板法

　　血球計(jì)數(shù)板是一種有特別結(jié)構(gòu)刻度和厚度的厚玻璃片，玻片上有四條溝和兩條嵴，中央有一短橫溝和兩個(gè)平臺(tái)，兩嵴的表比兩平臺(tái)的表面高0.1mm，每個(gè)平臺(tái)上刻有不同規(guī)格的格網(wǎng)，中央0.1 mm2面積上刻有400個(gè)小方格。通過油鏡觀察，統(tǒng)計(jì)一定大格內(nèi)微生物的數(shù)量，即可算出1mL菌液中所含的菌體數(shù)。這種方法簡(jiǎn)便、直觀、快捷，但只適宜于單細(xì)胞狀態(tài)的微生物或絲狀微生物所產(chǎn)生的孢子進(jìn)行計(jì)數(shù)，并且所得結(jié)果是包括死細(xì)胞在內(nèi)的總菌數(shù)。血球計(jì)數(shù)板構(gòu)造，如圖1。計(jì)數(shù)室構(gòu)造，如圖2。

　　為了彌補(bǔ)一些微生物在油鏡下不易觀察計(jì)數(shù)，而直接用血球計(jì)數(shù)板法又無法區(qū)分死細(xì)胞和活細(xì)胞的不足，人們發(fā)明了染色計(jì)數(shù)法。借助不同的染料對(duì)菌體進(jìn)行適當(dāng)?shù)娜旧梢愿奖愕脑陲@微鏡下進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。如酵母活細(xì)胞計(jì)數(shù)可用美藍(lán)染色液，染色后在顯微鏡下觀察，活細(xì)胞為無色，而死細(xì)胞為藍(lán)色。

　　將已知顆粒（如霉菌孢子或紅細(xì)胞）濃度的液體與一待測(cè)細(xì)胞濃度的菌液按一定比例均勻混合，在顯微鏡視野中數(shù)出各自的數(shù)目，即可得未知菌液的細(xì)胞濃度。這種計(jì)數(shù)方法比較粗放，并且需要配制已知顆粒濃度的懸液做標(biāo)準(zhǔn)。

　　對(duì)未知菌樣做連續(xù)十倍系列稀釋，根據(jù)估計(jì)數(shù)，從最適宜的三個(gè)連續(xù)的10倍稀釋液中各取5mL試樣，接種1mL到3組共15支裝培養(yǎng)液的試管中，經(jīng)培養(yǎng)后記錄每個(gè)稀釋度出現(xiàn)生長(zhǎng)的試管數(shù)，然后查最大或然數(shù)表MPN（most probably number）得出菌樣的含菌數(shù)，根據(jù)樣品稀釋倍數(shù)計(jì)算出活菌含量。該法常用于食品中微生物的檢測(cè)，例如飲用水和牛奶的微生物限量檢查。

　　1.8 平板菌落計(jì)數(shù)法

　　這是一種最常用的活菌計(jì)數(shù)法。將待測(cè)菌液進(jìn)行梯度稀釋，取一定體積的稀釋菌液與合適的固體培養(yǎng)基在凝固前均勻混合，或?qū)⒕和坎加谝涯痰墓腆w培養(yǎng)基平板上。保溫培養(yǎng)后，用平板上出現(xiàn)的菌落數(shù)乘以菌液稀釋度，即可算出原菌液的含菌數(shù)。一般以直徑9cm的平板上出現(xiàn)50-500個(gè)菌落為宜。但方法比較麻煩，操作者需有熟練的技術(shù)。平板菌落計(jì)數(shù)法不僅可以得出菌液中活菌的含菌數(shù)，而且同時(shí)將菌液中的細(xì)菌進(jìn)行了一次分離培養(yǎng)，獲得了單克隆。

　　在平板計(jì)數(shù)法的基礎(chǔ)上，發(fā)展了小型商品化產(chǎn)品以供快速計(jì)數(shù)用，形式有小型厚濾紙片、瓊脂片等。在濾紙和瓊脂片中吸有合適的培養(yǎng)基，其中加入活性指示劑2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC，無色），待蘸取測(cè)試菌液后，置密封包裝袋中培養(yǎng)。短期培養(yǎng)后，在濾紙上出現(xiàn)一定密度的玫瑰色微小菌落，與標(biāo)準(zhǔn)紙色板上圖譜比較，即可估算出樣品的含菌量。試劑紙法計(jì)數(shù)快捷準(zhǔn)確，相比而言避免了平板計(jì)數(shù)法的人為操作誤差。

　　用特殊的濾膜過濾一定體積的含菌樣品，經(jīng)丫-叮橙染色，在紫外顯微鏡下觀察細(xì)胞的熒光，活細(xì)胞會(huì)發(fā)橙色熒光，而死細(xì)胞則發(fā)綠色熒光。

　　1.11 測(cè)定含氮量

　　大多數(shù)細(xì)菌的含氮量為干重的12.5%，酵母為7.5%，霉菌為6.0%。根據(jù)含氮量剩以6.25，即可測(cè)定粗蛋白的含量。含氮量的測(cè)定方法有很多，如用硫酸、過氯酸、碘酸、磷酸等消化法和Dumas測(cè)N2氣法。Dumas測(cè)N2氣法是將樣品與CuO混合，在CO2氣流中加熱后產(chǎn)生N2，收集在呼吸計(jì)中，用KOH吸去CO2后，即可測(cè)出N2的量。

　　1.12 測(cè)定含碳量

　　將少量（干重0.2-2.0mg）生物材料混入1mL水或無機(jī)緩沖液中，用2mL 2%的K2Cr2O7溶液在100℃下加熱30min后冷卻。加水稀釋至5mL，在580nm的波長(zhǎng)下讀取吸光光度值，即可推算出生長(zhǎng)量。需用試劑做空白對(duì)照，用標(biāo)準(zhǔn)樣品做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

　　1.13 還原糖測(cè)定法

　　還原糖通常是指單糖或寡糖，可以被微生物直接利用，通過還原糖的測(cè)定可間接反映微生物的生長(zhǎng)狀況，常用于大規(guī)模工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)上微生物生長(zhǎng)的常規(guī)監(jiān)測(cè)。方法是，離心發(fā)酵液，取上清液，加入斐林試劑，沸水浴煮沸3min，取出加少許鹽酸酸化，加入Na2S2O3臨近終點(diǎn)時(shí)加入淀粉溶液，繼續(xù)加Na2S2O3至終點(diǎn)，查表讀出還原糖的含量。

　　微生物的檢測(cè)，其發(fā)展方向是快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、自動(dòng)化，當(dāng)前很多生物制品公司利用傳統(tǒng)微生物檢測(cè)原理，結(jié)合不同的檢測(cè)方法，設(shè)計(jì)了形式各異的微生物檢測(cè)儀器設(shè)備，正逐步廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)微生物檢測(cè)和科學(xué)研究領(lǐng)域。例如：

　　1、抗干擾培養(yǎng)基和微生物數(shù)量快速檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合 解決了傳統(tǒng)微生物檢測(cè)手段不能解決的難題，為建立一套完整的抗干擾微生物檢測(cè)系統(tǒng)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。中科院廣州分院合作產(chǎn)業(yè)處提供的抗干擾微生物培養(yǎng)基、新型生化鑒定管、微生物計(jì)數(shù)卡、環(huán)境質(zhì)量檢測(cè)試劑盒等，可方便的用于多項(xiàng)檢測(cè)。

　　2、BACTOMETER 全自動(dòng)各類總菌數(shù)及快速細(xì)菌檢測(cè)系統(tǒng) 可以數(shù)小時(shí)內(nèi)獲得監(jiān)測(cè)結(jié)果，樣本顏色及光學(xué)特征都不影響讀數(shù)，對(duì)酵母和霉菌檢測(cè)同樣高度敏感原理是利用電阻抗法 （IMPEDANCE TECHNOLOGY）將待測(cè)樣本與培養(yǎng)基置于反應(yīng)試劑盒內(nèi)，底部有一對(duì)不銹鋼電極，測(cè)定因微生物生長(zhǎng)而產(chǎn)生阻抗改變。如微生物生長(zhǎng)時(shí)，可將培養(yǎng)基中的大分子營(yíng)養(yǎng)物經(jīng)代謝轉(zhuǎn)變?yōu)榛钴S小分子，電阻抗法可測(cè)試這種微弱變化，從而比傳統(tǒng)平板法更快速監(jiān)測(cè)微生物的存在及數(shù)量。測(cè)定項(xiàng)目包括總生菌數(shù)，酵母菌，大腸桿菌群，霉菌，乳酸菌，嗜熱菌，革蘭氏陰性菌，金黃色葡萄球菌等。

　　益生菌不僅有很多種類（如芽孢桿菌、乳酸菌、酵母菌），其檢測(cè)方法也是非常之多。對(duì)不同的益生素，需要選擇適當(dāng)?shù)姆椒▉頇z測(cè)、計(jì)數(shù)。

　　目前常用的檢測(cè)是顯微鏡直接計(jì)數(shù)法和平板計(jì)數(shù)法兩種，顯微鏡直接計(jì)數(shù)法的最大優(yōu)點(diǎn)就是快速，而且此方法可以通用，即不同的益生菌種類都可以用同一方法檢測(cè)其數(shù)量；但其也有諸多缺點(diǎn)，如不能區(qū)分死菌和活菌，也不能區(qū)分形狀類似的不同益生菌，故其只能作為一種粗略、簡(jiǎn)單的方法。而平板計(jì)數(shù)法卻可以克服顯微鏡計(jì)數(shù)法的缺點(diǎn)，但其對(duì)操作人員素質(zhì)及操作能力要求都比較高，需要比較專業(yè)人員來操作。

　　針對(duì)目前選擇以平板計(jì)數(shù)來進(jìn)行測(cè)量益生菌的含量為主，本文也就此方法作一簡(jiǎn)單探討。

　　2.1.2 采用玻片直接涂布法，即在潔凈的玻片上劃1cm2正方形，然后吸取經(jīng)5～10倍稀釋的檢樣0.01mL涂布在方框內(nèi)，干燥固定后，先用甲醇處理5min再進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢，判斷大概菌數(shù)和菌種，則可預(yù)測(cè)分離培養(yǎng)應(yīng)選擇的培養(yǎng)基和稀釋倍數(shù)，如不能判斷，即認(rèn)為每克樣品含菌數(shù)小于105。

　　根據(jù)涂布的預(yù)測(cè)與產(chǎn)品說明，選擇相應(yīng)的培養(yǎng)基，見表1

　　2.3 檢測(cè)的操作

　　準(zhǔn)確稱取益生素樣品10g，放入裝有90mL無菌水的玻璃瓶中，用手或振蕩機(jī)振蕩20min，靜置約20min，即成10-1稀釋液；再用10mL無菌吸管，吸取10-1菌液10mL移入裝有90mL無菌水的玻璃瓶中，充分震蕩，即成10-2稀釋液；以此類推，每次更換吸管連續(xù)稀釋，直到制成適當(dāng)稀釋度的菌懸液。

　　2.3.2 平板接種：

　　用1mL無菌吸管吸取適當(dāng)稀釋度的菌懸液1mL到一個(gè)滅菌平皿中，接種好三個(gè)平皿，再在培養(yǎng)皿中分別倒入已融化并冷卻至45-50℃左右的培養(yǎng)基，蓋好蓋子，趁熱輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿，使菌液與培養(yǎng)基混合均勻，冷凝后倒置37℃下培養(yǎng)48～72h后長(zhǎng)出菌落后即可計(jì)數(shù)。

　　2.4 結(jié)果計(jì)算及說明：

　　將三個(gè)平皿的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)，即為每g益生素中所含的活菌數(shù)（如在10-8有30個(gè)菌落，即可計(jì)為3.0×109cfu/g或者cfu/mL）。選取菌落數(shù)在30-300之間的平皿作為菌落總數(shù)測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)。

　　3 討論

　　益生菌菌種的質(zhì)量是微生態(tài)調(diào)節(jié)劑生產(chǎn)的關(guān)鍵和質(zhì)量保證，因此在生產(chǎn)前必須作如下鑒定：

　　(1)菌株染色形態(tài)與菌落均應(yīng)具典型特征；

　　(2)生化反應(yīng)與糖發(fā)酵均應(yīng)符合伯杰氏細(xì)菌分類的特征；

　　(3)對(duì)于乳酸菌類須測(cè)定其代謝產(chǎn)物中的有機(jī)酸；

　　(4)血清學(xué)檢查、凝聚試驗(yàn)，效價(jià)不低于原效價(jià)的1/2；

　　(5)毒性試驗(yàn):濃菌液給小白鼠腹腔注射或灌胃試驗(yàn)，小白鼠應(yīng)無不良反應(yīng)出現(xiàn)；

　　(6)必要時(shí)作遺傳學(xué)特征的鑒定。

　　此外，我國(guó)對(duì)微生態(tài)調(diào)節(jié)劑的發(fā)展起步較晚，目前尚無統(tǒng)一檢測(cè)方法，故需不斷積累有關(guān)資料，通過研究完善和建立切實(shí)可行的方法是保證微生態(tài)調(diào)節(jié)劑的生產(chǎn)與質(zhì)量的必要手段。（作者：肖永友 來源：博仕奧生化研發(fā)中心）