副豬嗜血桿菌與Glässer氏病研究進展

4  臨床癥狀

副豬嗜血桿菌感染后出現(xiàn)的臨床癥狀與感染部位有關(guān)。Hoefling（1994）將其分為4種類型，即Glässer氏病（纖維素性多發(fā)性漿膜炎）、敗血癥型（無多發(fā)性漿膜炎）、急性肌炎型（myositis acuta ，見于咬肌）和呼吸病型。

各型臨床表現(xiàn)，其絕大多數(shù)都是非特異性的。病程呈最急性或急性經(jīng)過。發(fā)病豬通常是十分健壯的豬。最初的癥狀是體溫升高、精神沉郁和食欲減退，接著出現(xiàn)咳嗽、呼吸困難、體重下降、跛行、共濟失調(diào)、發(fā)紺、臥地不起等癥狀。有的病豬衰竭而死。

引起發(fā)燒的細菌和病毒有很多種，如胸膜肺炎放線桿菌、豬放線桿菌、豬鏈球菌、豬丹毒桿菌、豬鼻支原體、流感病毒等。對于這些需要通過鑒別診斷加以排除。

5  診斷

    副豬嗜血桿菌感染的臨床癥狀不具特異性，因此臨床診斷意義不大。確診病性需要進行實驗室檢驗。

5．1 病理變化

    本病的主要變化是在腹膜、心包、胸膜或關(guān)節(jié)面出現(xiàn)漿液-纖維素性或纖維素性化膿性炎癥。組織學(xué)檢查這些炎癥部位可見嗜中性白血細胞和巨嗜細胞浸潤。在重劇病例如腦膜炎、栓塞性腦膜腦炎，伴有腦脊液增多。肺部病變不典型。敗血癥病例可在肝、腎和腦等器官表面見到出血斑（點），同時血漿中內(nèi)毒素含量增加，各器官出現(xiàn)纖維素凝塊。伴有發(fā)紺、皮下水腫和肺水腫的急性敗血性病例不多見，也見不到典型的漿膜炎癥表現(xiàn)。

  5．2 病原分離

    從病料分離副豬嗜血桿菌，通常在接種了金黃色葡萄球菌的血液瓊脂上進行，目的是通過金黃色葡萄球菌為副豬嗜血桿菌的生長提供NAD。也可以選用巧克力瓊脂或者加有NAD的PPLO培養(yǎng)基。培養(yǎng)時間通常需要24~48h。本菌為難于培養(yǎng)的微生物之一，尤其是從病料中分離時，常常受到雜菌的干擾。解決的辦法，一是采用稀釋培養(yǎng)法，二是在培養(yǎng)基中加林肯霉素和抗菌肽。由于本菌為上呼吸道常在菌，因此，必須注意由呼吸道分離到本菌并不一定代表發(fā)生了全身性感染。但是，當(dāng)在腦和關(guān)節(jié)內(nèi)檢出副豬嗜血桿菌，其診斷價值就不容置疑了。另外，當(dāng)分離到副豬嗜血桿菌樣細菌時，必須對其作細致的生化鑒定，將之與其它不溶血的NAD依賴細菌如吲哚放線桿菌、豬放線桿菌和小放線桿菌等區(qū)別開。

5．3 血清定型

    如上所述，副豬嗜血桿菌的血清型已經(jīng)根據(jù)特異性兔抗血清免疫擴散試驗的結(jié)果，確定了15個血清型（1~15）。最近，還有人對不同的血清學(xué)分型方法[免疫擴散試驗(ID)、間接血凝試驗（IHA）和協(xié)同凝集試驗（CA）]進行了比較研究（Río等，2003；Tadjine等，2004；Turni和Blackall，2005）。

    Turni和Blakall(2005)比較了ID和IHA檢測野毒株的結(jié)果后發(fā)現(xiàn)，IHA產(chǎn)生比ID更多的不可分型菌株，前者達44％，后者為41％。Del Rio等（2003）和Tadjine等（2004）的研究則認為，最適合副豬嗜血桿菌血清分型的方法應(yīng)該是IHA，因為IHA減少血清學(xué)不可分型的百分數(shù)至少比ID或CA低10％。其他學(xué)者詳細分析了Del Rio和Tadjine等的研究結(jié)果后發(fā)現(xiàn)，他們的研究方法有缺陷，即所檢測的菌株沒有一株是國際認可的標(biāo)準(zhǔn)菌株，所采用的抗原提取技術(shù)也沒有經(jīng)GD試驗校正。因此，他們的研究結(jié)果受到質(zhì)疑。

    分離菌株不可定型的原因，可能是其所含型特異抗原的數(shù)量不足，也可能是至今尚未被認知的血清新型。ID和IHA分型結(jié)果出現(xiàn)差異的原因，是由于所用的可溶性天然抗原都是用于ID的。因為，IHA試驗是用可溶性抗原包被紅血細胞，其結(jié)果是把沉淀抗原當(dāng)凝集抗原使用，從而使IHA試驗的敏感性比ID試驗提高了3000倍（Mittla，2003）。

5.4 抗體檢測

    補體結(jié)合試驗（CF）、間接血凝（IHA）試驗和ELISA試驗都可用于檢測副豬嗜血桿菌的抗體。急性病例經(jīng)過一周的病程即可檢出抗體，但都有較明顯的型交叉反應(yīng)性。Takahashi等（2001）作了免疫接種試驗，他通過CF試驗檢測抗體滴度，其結(jié)果在二免后19d呈現(xiàn)陽性滴度。研究發(fā)現(xiàn)，無論是用超聲粉粹的還是用加熱煮沸的菌體作包被綿羊紅細胞的抗原進行IHA，無論是用煮沸細菌的上清液還是用酚：水熱抽提物透析液作抗原進行ELISA，都只能獲得不穩(wěn)定的陰性結(jié)果，特別是在檢測免疫動物時。因此說，這些試驗不宜用于檢測免疫保護反應(yīng)。但是，如果改用福爾馬林滅活的全菌體作抗原進行ELISA試驗，則可用于研究母豬的抗體滴度和仔豬的疫苗接種反應(yīng)。

5.5 分子生物學(xué)方法

    這類方法中，一個很有應(yīng)用前景的方法是寡核苷特異性捕捉平板雜交試驗（OSCPH，oligonucleotide-specific capture plate hybridization），其敏感性很高，為102CFU/mL純培養(yǎng)物。問題是不容易獲得純培養(yǎng)物。因此，又建立了一種能直接鑒定病料中副豬嗜血桿菌的PCR方法，其敏感性亦達102CFU/mL。而且，可以用于檢測已滅活的病菌。然而，這兩種方法對吲哚放線桿菌都可以呈現(xiàn)弱陽性反應(yīng)。由此，Oliveira和Pijoan（2004）推薦這兩種方法只用于檢測呼吸道以外的副豬嗜血桿菌，因為吲哚放線桿菌是上呼吸道中的常在菌。

5.6免疫組化診斷

     由于雜菌滋長而使副豬嗜血桿菌分離異常艱難，因此有人推薦用免疫組化法（IHC）來診斷副豬嗜血桿菌感染。IHC的優(yōu)點是，即使副豬嗜血桿菌已被巨噬細胞殺滅而遺骸于胞漿中，也可輕易地被檢測到。

    問題是本方法中所使用的多克隆抗體與胸膜肺炎放線桿菌有交叉反應(yīng)（Segales等，1997）。

6  治療和預(yù)防

    與其它疾病一樣，衛(wèi)生惡劣、營養(yǎng)不適和管理不當(dāng)?shù)日T因都可以促進副豬嗜血桿菌感染的發(fā)生和流行。特別是無序轉(zhuǎn)群，以及在同一圈內(nèi)飼養(yǎng)不同年齡的豬只，更是促成本病暴發(fā)的誘因。

6.1 抗菌素治療

    副豬嗜血桿菌病可以用抗菌素治療。治療要求盡早盡快，癥狀一旦出現(xiàn)即應(yīng)經(jīng)胃腸外途徑給藥。用藥劑量因癥而異。對于Glässer氏病，由于病原進入組織和腦脊液以及侵害關(guān)節(jié)，用藥劑量一定要大。

    用什么抗菌素，應(yīng)該根據(jù)藥敏試驗結(jié)果來選擇。有關(guān)本菌抗藥性的報道不多、瑞士分離到的所有副豬嗜血桿菌菌株對青霉素和恩氟沙星均敏感，對鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素、四環(huán)素、紅霉素、磺胺嘧啶和TMP+磺胺嘧啶都有抗性（wissing等，2001）。丹麥菌株對所測抗菌藥物(氨芐青霉素、頭孢替福、環(huán)丙沙星、紅霉素、氟苯尼考、青霉素、壯觀霉素、四環(huán)素、硫粘菌素、替米考星、TMP+磺胺甲基異惡唑)都十分敏感（Aarestrup等，2004）。

6.2 免疫預(yù)防和疫苗接種

    通過疫苗接種來控制副豬嗜血桿菌感染，可能比較實用些。雖然對本菌的毒力因子和保護性抗原何在還不清楚，但確實存在型特異性的免疫力。所用疫苗可以由廠家購買，也可以制作自家菌苗。在自家菌苗控制疾病的過程中，既要考慮制苗菌株的血清型，也要重視制苗菌株的其他因子。因為從一頭豬可以分離到強毒至無毒的各種菌株。由此推薦：最好使用由腦內(nèi)分離到的菌株來制備自家菌苗；否則，如果用從關(guān)節(jié)和身體其他部位分離到的菌株制苗，免疫效果會變差，而用肺內(nèi)菌株制備則可能幾乎無效。其原因如前所述，不同部位來源的菌株有非常高的異源性（heterogencity）。

    由于副豬嗜血桿菌血清型的多樣性和大比例的不能定型的分離物的存在，迫使人們在努力尋找能夠產(chǎn)生交叉保護力的疫苗。Miniats等（1991）曾經(jīng)試圖使用含有高致病力或低致病力菌株的菌苗來誘導(dǎo)交叉保護性免疫反應(yīng)。結(jié)果是，抵抗同源性和異源性菌株的交叉保護作用只有用毒力菌株制備的菌苗才能得到，低致病力菌株制備的菌苗接種的豬，僅能保護同源菌株的攻擊。Rapp-Gabrielson等（1997）在研究血清2、4、5、12、13和14型間的交叉保護性時發(fā)現(xiàn)，除了血清12型制備的單菌和血清2、12型制備的二價苗外，其他型都能對同源菌株產(chǎn)生保護；用血清4型制備的菌苗，可以保護血清5型的攻擊；用血清4、5型制備的二價菌苗，可以抵抗血清13、14型的攻擊（仔豬病變的嚴重性和病死率明顯降低）。該作者還進一步研究了血清12型菌苗對同源菌株的保護性反應(yīng)。血清12型有12a和12b兩個亞型，分別以之制備菌苗來免疫豬發(fā)現(xiàn)，以12a制備的菌苗不能產(chǎn)生同源性保護，而用12b免疫，則能產(chǎn)生顯著的同源性保護。這些事實表明，盡管血清12型菌株都是高致病性的，也能產(chǎn)生相似的OMP和LPS，但菌苗中所表達的保護性抗原肯定是有所不同的。Takahashi等（2001）研究了血清2和5型之間的交叉保護性，證明單價菌苗免疫不能產(chǎn)生交叉保護，但用其二價菌苗免疫，然后用致死量的2、5型菌株分別攻擊，雙雙都能獲得保護。Bak和Riising（2002）研究了血清5型+DiluvacForte佐劑菌苗的保護性，仔豬在5周齡和7 周齡接種菌苗后，所產(chǎn)生的保護力不僅能抵抗血清5型同源菌株的攻擊，而且對血清1、12、13和14 型等異源菌株的攻擊也都能產(chǎn)生明顯的保護作用。

    為了預(yù)防仔豬發(fā)病，可以讓仔豬小劑量地感染致病性菌株。該方法的理論基礎(chǔ)是基于這樣一種假設(shè)：在自然狀態(tài)下，豬群中很少有豬定植有致病性菌株；細菌早期定植于仔豬后，仔豬不僅可因有母源抗體而免發(fā)全身性感染，當(dāng)母源抗體減少時仔豬能獲得主動免疫反應(yīng)。有人通過田間試驗證實了這種假設(shè)，即仔豬在5日齡時經(jīng)口接種7×103CFU強毒活菌，感染豬的病死率比對照豬降低了2.88%。但要切記：感染有PRRS病毒的豬不能使用這種方法。

    疫苗接種的另一個問題是用苗時機問題。有學(xué)者不同意疫苗接種影響自動免疫的觀點。他們證明：對母豬和仔豬接種疫苗同樣有效，認為初乳抗體不能干擾疫苗效果。也有人持不同觀點，如果母豬什么都不接種，只是仔豬接種疫苗，結(jié)果無效。因此，為了保證仔豬斷奶前和斷奶后都能對疫苗接種產(chǎn)生免疫反應(yīng)，有必要重視設(shè)計疫苗接種的策略。Oliveira和Pijoan(2002)證實，母豬分娩前免疫產(chǎn)生的乳汁免疫以及斷奶仔豬的疫苗接種和再接種都能夠提供必要的保護作用。

7   結(jié)論與建議

    在過去的數(shù)年中，雖然人們愈益重視了對副豬嗜血桿菌感染的研究，但至今仍有許多問題不能得到滿意的回答。特別是對毒力因子的檢測、毒力因子的作用機理、診斷方法的改進和新型廣譜疫苗的研發(fā)等，需要格外重視加以研究。

    在我國，在注視PRRS病毒、PR病毒、豬圓環(huán)病毒、豬細小病毒等疫情的同時，應(yīng)該注意到副豬嗜血桿菌的并發(fā)或繼發(fā)感染（幫兇）作用。尤其在集約化程度很高的大型豬場，更應(yīng)汲取國外的經(jīng)驗教訓(xùn)，更加重視副豬嗜血桿菌的潛在危害性。在疫苗研究過程中，要根據(jù)我國豬場疫情的特殊性，要著手研制副豬嗜血桿菌多價苗，還要開始研制預(yù)防多種疾病的聯(lián)苗。