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非洲豬瘟病毒（ASFV）是非洲豬瘟病毒科家族的唯一成員，是一種大型（200nM）復(fù)雜的囊膜雙鏈DNA病毒。ASFV可感染家豬和野豬，擴散快，致死率高（可達(dá)100%），對豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟后果。

近期，美國農(nóng)業(yè)部下屬的研究機構(gòu)在Journal of Clinical Microbiology雜志上發(fā)表了針對非洲豬瘟病毒的首個結(jié)合樣品富集、納米孔MinION測序技術(shù)、以及新型快速分析軟件的報告，實現(xiàn)對該病毒基因組序列的真正實時檢測。

由于目前尚無控制非洲豬瘟（ASF）的有效疫苗，基于檢測追蹤、流行病學(xué)調(diào)查、減少人員接觸以及消毒等控制措施，在當(dāng)病毒脫落或其他的病毒和細(xì)菌感染產(chǎn)生相似的癥狀時，這些方法就會變得非常復(fù)雜。因此，分子水平進(jìn)行早期快速檢測和診斷有益于早期發(fā)現(xiàn)和更加有效的控制豬瘟。

美國農(nóng)業(yè)部國家獸醫(yī)服務(wù)實驗室等研究機構(gòu)比較了現(xiàn)有的測序平臺，發(fā)現(xiàn)基于NGS平臺的工作流程需要大量資源進(jìn)行樣本和測序文庫準(zhǔn)備，檢測周期長（最少17個小時來獲取原始數(shù)據(jù)），儀器投入資本高。另外，ASFV基因組大小約為180kb，兩端為反向重復(fù)序列，該病毒的大小也一直阻礙著獲得其全基因組序列的研究工作。而在滿足快速檢測和鑒定ASFV的需求上，MinION測序儀具備了低前期投資成本、快速樣本制備方案、可生成有效覆蓋基因組的長讀長序列、可直接讀取DNA，并且能夠?qū)崟r生成數(shù)據(jù)的優(yōu)勢。

基于便攜式MinION納米孔測序，他們開發(fā)出了非洲豬瘟快速分析測序工具（ASF-FAST）和富集策略，能夠在數(shù)分鐘內(nèi)獲得并快速分析非洲豬瘟病毒基因組，該方法有助于高效的緊急管理和疾病控制干預(yù)，減少經(jīng)濟損失。結(jié)果顯示測序開始后的6分鐘內(nèi)便檢測到ASFV的特異讀長，無論起始材料，均能夠在10分鐘內(nèi)生成足夠的數(shù)據(jù)完成ASFV的基因組分析（高達(dá)100%）。該研究成果發(fā)表在Journal of Clinical Microbiology雜志。DOI: 10.1128/JCM.01104-19。

在實驗中，研究小組比較了未處理樣品和富集樣品的序列特異度和時間，發(fā)現(xiàn)從富集的樣品中識別到ASFV基因組更快，更富特異性。在富集的樣品中，生成總讀長序列54743個，其中23208個含有ASFV特異性序列（42.39%），生成的第一個原始讀長即識別到了99%的基因組；對于未處理的樣品，生成了4307個總讀長序列，其中868個含有ASFV特異性序列（20.15%）。另外，去除甲基化宿主DNA提升了病毒特異性測序性能。

在生成完整基因組序列所需的時間方面，富集樣本速度更優(yōu)于未處理樣本：生成99%的基因組序列，富集后的樣本僅需不到10分鐘，而未處理樣本則需要64分鐘。證實將長讀長納米孔測序技術(shù)與ASF-FAST軟件結(jié)合使用，能夠經(jīng)濟快速，實時地從診斷樣品中分離出完整的ASFV基因組。

在評估MinION平臺用于流行病學(xué)評估的快速鑒定的可行性方面，作者使用ASF -FAST軟件分析了四株遺傳學(xué)上不同的ASFV分離株的序列數(shù)據(jù)。他們發(fā)現(xiàn)在測序運行開始的10分鐘內(nèi)，所有富集樣本90%的基因組均得到了解析。使用新鮮的和凍干血液樣本，全基因組序列可在約4小時內(nèi)獲得。

作者在文章最后表示，納米孔技術(shù)作為一種重要的工具，能夠被世界其它許多受ASFV威脅的地方和地區(qū)所利用進(jìn)行快速監(jiān)視，應(yīng)用于那些沒有復(fù)雜基礎(chǔ)設(shè)施的實驗室和現(xiàn)場。大多數(shù)實驗室都可以以最小的資金投入輕松獲得MinION設(shè)備，迅速拓展能力進(jìn)行對ASFV的表征。

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