畜牧人
標(biāo)題: 豬偽狂犬病診斷方法研究進(jìn)展 [打印本頁(yè)] 作者: kinki0396 時(shí)間: 2007-7-13 10:36標(biāo)題: 豬偽狂犬病診斷方法研究進(jìn)展偽狂犬病 (Pseudorabies ， PR) 由偽狂犬病毒 (Pseudorabies virus ， PRV) 引起，最早發(fā)現(xiàn)于美國(guó)，因臨床表現(xiàn)與狂犬病類似，故稱偽狂犬病。該病在全球范圍內(nèi)的流行呈上升趨勢(shì)，世界上已有 50 多個(gè)國(guó)家和地區(qū)報(bào)導(dǎo)該病的流行。我國(guó)自 1947 年劉永純從豬體分離到 PRV 以來，已有 24 個(gè)省 ( 市 ) 、自治區(qū)報(bào)導(dǎo)流行 [1] 。文章主要對(duì)血清學(xué)、分子生物學(xué)診斷與檢測(cè)方法以及鑒別診斷方法進(jìn)行綜述。
成年豬無明顯癥狀，母豬流產(chǎn)或產(chǎn)死胎，仔豬表現(xiàn)神經(jīng)癥狀，肌肉振顫，嚴(yán)重時(shí)四肢劃水樣運(yùn)動(dòng)，體溫升高達(dá) 41 ℃ ～ 42 ℃ 。取 PR 病例的腦和脊髓做成組織切片，蘇木素 - 伊紅染色后觀察呈現(xiàn)非化膿性腦炎變化，其他大體剖檢特征不明顯。在神經(jīng)細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞和毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞可檢出 A 型核內(nèi)包涵體。
將典型病例病料懸液給家兔、小鼠或雞胚接種，觀察其臨床癥狀的出現(xiàn)從而確診。家兔出現(xiàn)精神委頓，體溫升高，繼而注射部位出現(xiàn)奇癢癥狀，隨即肌肉痙攣，角弓反張，最后死亡。小鼠接種后有奇癢癥狀，持續(xù) 12 h ，在 2 d ～ 5 d 內(nèi)死亡。雞胚接種后 3 d ～ 4 d 后，病毒侵害神經(jīng)系統(tǒng)，雞胚死亡 [2] 。
中和試驗(yàn) (serum neutralization test ， SN) 又稱微量血清中和試驗(yàn) (mircoserum neutralization test ， MSNT) ，作為病毒檢測(cè)的經(jīng)典方法，是世界上多數(shù)國(guó)家檢測(cè) PR 的法定方法之一 [3] 。
方六榮等 [4] 用 MSNT 進(jìn)行了 PR 的血清學(xué)調(diào)查。通過監(jiān)測(cè)中和指數(shù)和中和效價(jià)，發(fā)現(xiàn) SNT 的特異性很強(qiáng)，但敏感性較低。如果延長(zhǎng)抗原與血清的孵育時(shí)間，尤以補(bǔ)體存在時(shí)，可使其敏感性增高。由于該法操作繁瑣，工作量大，且受技術(shù)、細(xì)胞等條件限制，給實(shí)際應(yīng)用帶來一定的困難。
乳膠凝集試驗(yàn) (latex agglutination test ， LAT) 利用抗原抗體特異性結(jié)合的性質(zhì)，先用乳膠包被抗原，再與相應(yīng)血清反應(yīng)，如幾分鐘內(nèi)發(fā)生凝集，可判定有 PRV 感染。日本的柴因勛對(duì)比了 LAT 和 SNT ，檢驗(yàn)了 1 659 份血清樣品，發(fā)現(xiàn) LAT 和 SNT 的相符程度達(dá) 97.6% 。且由于 LAT 可以檢測(cè)有很強(qiáng)凝集活性的 IgM ，可以早于 SNT 檢測(cè)到 PR 病毒的抗體。國(guó)內(nèi)吳斌等 (1997) 做了同類試驗(yàn)也表明 LAT 和 SNT 間無統(tǒng)計(jì)上的差異。美國(guó)已經(jīng)有商品化的 LAT 試劑盒供臨床使用 [5] ，華中農(nóng)大也于國(guó)內(nèi)率先研制成功 LAT 試劑盒。 LAT 操作簡(jiǎn)單、方便、快速，且敏感性、特異性強(qiáng)，適用于疫病監(jiān)測(cè)或流行病學(xué)調(diào)查，以及種豬群檢疫凈化陽(yáng)性豬初次篩選。與 SNT 相比， LAT 具有更加廣闊的推廣前景 [6] 。
Stewart 等 (1967) 首先應(yīng)用熒光抗體染色法 (immunofluorescence ， IF) 檢查分別以病毒和病料接種的 PK-15 細(xì)胞培養(yǎng)物，獲良好結(jié)果。用免疫熒光技術(shù)對(duì)采自不同組織的病料進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，扁桃體和淋巴結(jié)的檢出率最高，其次是大腦、脾和脊髓。黃駿明等 (1995) 報(bào)導(dǎo)建立了檢出率在 95% 以上的直接免疫熒光試驗(yàn)。取病豬的腦三叉神經(jīng)、延腦和脊髓等組織作冰凍切片后免疫熒光檢查，可于 2 h ～ 4 h 內(nèi)得到結(jié)果。此法是我國(guó)目前用于 PR 快速診斷的一種較好的方法。
酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) (enzyme-Iinked immunosorbent assay ， ELISA) 具有快速、簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)， IgM-ELISA 還可早期檢測(cè) [7] 。 OIE 將其作為診斷豬 PR 的首選血清學(xué)方法。美國(guó)也將 ELISA 作為 3 種 PR 的法定檢測(cè)方法之一。
用 ELISA 檢測(cè) PRV 抗體的方法由 Snyder 等 (1978) 首創(chuàng)。 Homme P 等 (1997) 將 PRV gD 基因在桿狀病毒中表達(dá)，制成重組抗原并建立了競(jìng)爭(zhēng) ELISA(cELISA) 。用此法可檢測(cè)到感染 2 周后血清陽(yáng)轉(zhuǎn)的情況。 Gut M 等 [8] 用同樣載體表達(dá)了 gE 糖蛋白和 gI 糖蛋白，構(gòu)建了直接競(jìng)爭(zhēng) ELISA(gE/gI -ELISA) ，試驗(yàn)證明 gE/gI ELISA 比 gE-ELISA 的敏感性和特異性更強(qiáng)，還可用于檢測(cè)感染 2 周齡的早期感染豬血清中的抗體。
婁高明等 (1998) 建立了檢測(cè) PRV 抗原的雙抗體夾心 ELISA 法，因其操作簡(jiǎn)便，不需要昂貴的儀器，因此適合大規(guī)模的檢驗(yàn)檢疫。四川農(nóng)業(yè)大學(xué)的曹三杰等 [9] 建立了 Dot-PPA-ELISA ，可檢測(cè)最低 IgG 含量為 1.398×10 － 8 g 。中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所研制的 Dot-ELISA 試劑盒已投入使用 [10] 。
1977 年 Gutekunst D E 等首次報(bào)道了利用微量免疫擴(kuò)散試驗(yàn) (microimmunodiffusion test ， MIDT) 檢測(cè)了 2 200 多頭豬血清中的 PRV 抗體，其陽(yáng)性結(jié)果與 SNT 相同 [11] 。此法所得結(jié)果不受血清污染、溶血和細(xì)胞毒素等條件的影響，具備經(jīng)濟(jì)和操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、特異的優(yōu)點(diǎn)，但敏感性不高。 Willam P(1994) 分別對(duì) MIDT 、 SNT 、對(duì)流免疫電泳 (countercurrent immunoelectrophoresis ， CIE) 進(jìn)行了比較， 3 種方法的檢測(cè)結(jié)果也很接近。國(guó)內(nèi)的黃生 (1989) 、吳斌 (1997) 在做了同類的比較試驗(yàn)后認(rèn)為 MIDT 操作簡(jiǎn)單，結(jié)果準(zhǔn)確，適合基層和大型豬場(chǎng)使用。
2.6 血凝試驗(yàn)與血凝抑制試驗(yàn)
Tetsu N 等 (1989) 發(fā)現(xiàn) PRV 可以凝集 Balb/c 小鼠紅細(xì)胞，并以此建立了 PRV 的血凝試驗(yàn)與血凝抑制試驗(yàn) (hemagglutination or HA-inhibition ， HA 或 HI) ，檢查豬血清抗體的結(jié)果與 SNT 緊密相關(guān)，但是 HI 效價(jià)較低。 Inaba Y 將抗原與血清孵育時(shí)間延至 48 h ，再加補(bǔ)體繼續(xù)孵育 1 h ，效價(jià)比前法高 2 倍～ 32 倍。但是， Yamada S 等研究發(fā)現(xiàn) gC-PrV 突變株不能凝集紅細(xì)胞。吳平等 (1991) 用單克隆抗體致敏綿羊紅細(xì)胞，建立了反向間接血凝抑制試驗(yàn)， SNT 符合率為 94% 。
Narita 等 (1982) 建立了免疫組化技術(shù)檢測(cè)組織中重激活的 PRV 。 Ducatelle 等 (1982) 用免疫過氧化物酶技術(shù)檢測(cè)了 61 頭有神經(jīng)癥狀的病豬，發(fā)現(xiàn)與病毒分離試驗(yàn)試驗(yàn)相符程度為 95% 。 Afsher 等 (1986) 建立了可對(duì) PRV 進(jìn)行定量分析的免疫過氧化物酶蝕斑染色方法 [12] 。
除以上方法外，還有補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、皮膚變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)、放射免疫試驗(yàn) [13] 和對(duì)流免疫電泳等試驗(yàn)可用于 PR 的診斷。
核酸探針又稱核酸雜交 (ribonucleotide hybridization) ，具有高特異性、高敏感性的特點(diǎn)，已被用于 PR 的診斷。 Brown T M 等 (1988) 建立了檢測(cè)感染豬體內(nèi) PRV-DNA 的原位雜交法 [14] 。 Linne T(1987) 報(bào)道的斑點(diǎn)雜交法中，用 P32 標(biāo)記的探針在感染后 4 h 就可檢出組織中的病毒 DNA ，而分離病毒需要 1 d ～ 2 d 。 Maes R K 等 [15] 用生物素和地高辛標(biāo)記探針，其敏感度為 1 pg ～ 5 pg 。郭萬(wàn)柱 (1991) 等也用全基因組和重組質(zhì)粒制備了 P32 標(biāo)記的探針，成功的檢測(cè)了 10 pg 的 PRV DNA 。李學(xué)伍等 (1997) 利用 PCR(polymerase chain reaction ， PCR) 特異性擴(kuò)增產(chǎn)物制備地辛高標(biāo)記的探針，對(duì)閩 A 株、鄂 A 株、 Baratna 株、英國(guó)株及臨床病料進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果與 PCR 檢測(cè)結(jié)果相符，準(zhǔn)確率為 100% ，靈敏度達(dá)到 2 pg DNA 。在沒有 PCR 技術(shù)之前，核酸原位雜交技術(shù)是短時(shí)間檢查 PRV 潛伏感染的最敏感的方法。
Belak S 等 (1989) 率先建立了 PCR 檢測(cè) PRV 的方法。 Jestin A 等 (1990) 由鼻拭子抽提核酸，擴(kuò)增 gD 基因序列而檢測(cè)到 PRV 。李學(xué)伍等 (1998) 研究發(fā)現(xiàn)， PCR 的敏感性顯著高于 MSNT ， PRV 檢出率最高的組織為三叉神經(jīng)節(jié) (100%) 。 Galeota-wheeler 等通過合成擴(kuò)增 gD 基因的引物，從豬的扁佻體、三叉神經(jīng)節(jié)、嗅球和腦干中檢測(cè)出了潛伏感染的 PRV DNA 。 Talmage T B 等 [16] 應(yīng)用來自 gB(g) 基因的寡核苷酸引物對(duì)活檢的扁桃體細(xì)胞或?qū)嵸|(zhì)組織進(jìn)行擴(kuò)增，可檢查潛伏感染。其還通過應(yīng)用來自 gB 基因的嵌套引物對(duì) PRV DNA 進(jìn)行扁桃體細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)增并應(yīng)用原位雜交來探查細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)增的 DNA ，大大提高了檢出率。 Cheung A K[17] 也通過 PCR 在 14 頭豬中檢出三叉神經(jīng)節(jié) (100%) 和扁桃體 (86%) 中的潛伏感染。 PCR 敏感性高，特異性好，費(fèi)時(shí)少，可作為活體檢查用。
目前， PR 防控中使用了大量的疫苗，以上的檢測(cè)方法無法區(qū)分疫苗毒和野毒的感染，要區(qū)分疫苗接種動(dòng)物和野毒感染動(dòng)物，就需要以下的鑒別診斷方法。
Lomniczi B 等 (1984) 對(duì) Bartha 和 Norden 等疫苗毒株及 Ka 等野毒株 DNA 用 BamH Ⅰ ， Bgl 和 Kpn 酶切分析，發(fā)現(xiàn)弱毒株在 US 區(qū)有缺失。 Gielkens A L J 等 (1985)NIA-3 等野毒株和 Bartha ， BUK ， Ercegovac ， B-KAL 和 MK-25 5 個(gè)弱毒疫苗株 DNA 以 BamH Ⅰ 酶切分析也證實(shí)疫苗株在 US 區(qū)缺失，導(dǎo)致酶切圖譜改變。此法可用于流行病學(xué)調(diào)查。
根據(jù)疫苗株所缺失的糖蛋白可將鑒別 ELISA 分為 gE-ELISA 、 gC-ELISA 和 gG-ELISA 。其中 gE-ELISA 敏感性最高，應(yīng)用較多，最早由荷蘭的 Van Oirschot J T 等 (1986) 建立，其敏感性好于 SNT 。 Morenkov O S 等 [18] 建立了兩種檢測(cè) PR gE 抗體的間接 ELISA 。一種是利用大腸埃希菌表達(dá) gE 基因 N 末端氨基酸 1 位～ 125 位的融合蛋白而建立的重組 gE-ELISA ，一種是利用親和層析技術(shù)從病毒粒子中提純的天然 gE 蛋白而建立的親和層析 gE-ELISA 。這兩種 ELISA 法均可區(qū)分 gE 基因缺失苗免疫與野毒感染所產(chǎn)生的抗體。美國(guó)和歐共體規(guī)定，使用的疫苗至少要缺失 gE 基因，利用 gE-ELISA 就可將疫苗株和野毒株區(qū)分開，從而逐步根除 PR 。
此外， Cook 等 (1990) 建立了檢測(cè)抗 gG 抗體的阻斷 gG-ELISA ，該方法可以區(qū)分疫苗株與野毒株，但敏感性不如常規(guī) ELISA 法 [19] 。有研究發(fā)現(xiàn)在有母源抗體存在的情況下， gG 缺失株疫苗免疫原性好于 gE 缺失株。唐勇等也建立了 gC-ELISA 鑒別診斷方法，并成功的制成了試劑盒 [20] 。
ELISA 方法敏感性高、特異性強(qiáng)，而且簡(jiǎn)便、快速、重復(fù)性好，適于大量樣品的檢測(cè)，是目前最好的鑒別診斷方法。但要注意根據(jù)不同地區(qū)或豬場(chǎng)所使用的基因缺失疫苗關(guān)聯(lián)的 ELISA 法，以免造成誤診。
Scherba G 等 (1992) 在根據(jù) gG 基因和 lacz 基因設(shè)計(jì)了上下游引物，建立了區(qū)分 PRV 疫苗株與野毒株的 PCR 方法，并通過對(duì) PCR 產(chǎn)物進(jìn)行 Southern 雜交和液相色譜分析建立了定量 PCR 技術(shù)。 Hasebe H 等 (1993) 根據(jù) gD 和 gE-g I 基因序列設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，對(duì)人工感染 Bartha 、 BUK 以及另外 5 株野毒的豬組織 DNA 進(jìn)行擴(kuò)增，也能有效地區(qū)分強(qiáng)弱毒。冉智光 (1998) 等分別根據(jù) gB 和 gE 設(shè)計(jì)兩對(duì)引物建立了復(fù)合 PCR 鑒別診斷方法，成功的將國(guó)內(nèi)普遍防疫使用的 Bartha-K61 株和野毒株區(qū)分開。劉莉娜等 [21] 建立了多重 PCR ，檢出了 106 pg 的基因缺失苗毒且特異性好。陳陸等 [22] 建立了 gE/gB 鑒別診斷方法，敏感、特異且可以檢測(cè)潛伏感染。
應(yīng)用電子顯微鏡可以直接觀察 PRV 粒子。王家富等 (1996) 在電鏡下觀察純化的 PRV 湖北株，發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)與皰疹病毒極為相似，成熟的病毒顆粒呈球形或圓形，直徑在 200 nm ，囊膜較厚，病毒外周可看到纖突，也可以看到直徑約 150 nm 的小囊膜病毒、未成熟病毒粒子。
目前，可以用來診斷豬 PRV 的多種檢測(cè)手段中，傳統(tǒng)檢測(cè)手段可靠，但往往操作較復(fù)雜，或耗時(shí)較長(zhǎng)，實(shí)際應(yīng)用有一定困難。血清學(xué)檢測(cè)手段，尤其是研制成功的 LAT 和部分 ELISA 試劑盒操作簡(jiǎn)單、方便，不需要使用昂貴復(fù)雜的儀器，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用，特別是鑒別 ELISA 試劑盒可鑒別野毒感染和疫苗免疫動(dòng)物，但一些 ELISA 方法還不夠完善仍，是有待解決的問題。分子生物學(xué)方法特別是 PCR 技術(shù)，隨著研究的深入將更加趨于敏感、簡(jiǎn)便、快速、實(shí)用化。目前，美國(guó)和歐盟國(guó)家已經(jīng)啟動(dòng)了 PR 撲滅計(jì)劃。建立和完善可用于我國(guó) PR 的控制以致最終消滅該病的診斷方法，是我國(guó)廣大獸醫(yī)科技工作者面臨的重大課題之一。
作者: daijixin1 時(shí)間: 2007-7-13 10:45作者: syz 時(shí)間: 2007-7-13 16:05作者: xiazai 時(shí)間: 2007-7-30 11:28作者: zhangmc 時(shí)間: 2007-8-11 16:53作者: lyczhn1 時(shí)間: 2007-12-27 10:30作者: jku002 時(shí)間: 2007-12-29 09:02作者: 趕海人 時(shí)間: 2008-1-2 19:59作者: !中國(guó)畜牧人! 時(shí)間: 2008-2-29 22:14作者: kdm6000 時(shí)間: 2008-3-4 21:23作者: 張文豪 時(shí)間: 2008-5-8 15:29
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