b. 顆粒血細胞和半顆粒血細胞（或稱為大顆粒血細胞和小顆粒血細胞）: 脫粒后, 酚鹽原, 抗微生物肽 和黏著蛋白被釋放出來。接著是黏著，調(diào)理和膠囊化。活性氧簇給釋放出來。
c. β-1, 3-結(jié)合蛋白: 識別
d. 絲氨酸蛋白酶: 酚鹽原的激活,
3.水產(chǎn)疾病治療反對使用抗生素
a.抗生素抑菌的發(fā)展
b. 抗生素藥物殘留和抗菌范圍的狹窄
c.菌群環(huán)境的破壞
d. 對魚免疫系統(tǒng)的抑制作用
e. 成本相對較高
f. 在一些病例中的邊緣效果
4. 替代性食入策略的進展
a. 營養(yǎng)免疫的強化
b. 免疫興奮劑
c. 代謝修飾因子
d. 被動免疫調(diào)節(jié)劑, 例如雞蛋的免疫球蛋白Y,
e. 消化道菌群的改造成分: 益生菌，益生素和生物合成物
II.
魚胃腸道微生物生態(tài)學的概述 (20 min)
1. 需氧型胃腸道菌群(Burr 等. 2005)
脊椎動物何謂脊椎動物的胃腸道微生物的不同生態(tài)系統(tǒng)提供了棲息場所。這些微生物在宿主的健康和營養(yǎng)方面起了重要的作用。脊椎動物的胃腸道是厭氧環(huán)境，但是魚胃腸道的菌群，特別是厭氧菌群卻極少被了解和研究。魚類菌群的特征性研究大多集中在需氧型上(reviewed in Cahill 1990; Ringø 1993; Spanggaard et al. 2000; and Huber et al.2004), 這決定了優(yōu)勢菌群是間性厭氧菌而不是嚴格的厭氧菌。用需氧的方法培養(yǎng)細菌使一些研究者們得出厭氧菌在魚胃腸道起著微小作用的結(jié)論。Spanggaard 等. (2000)總結(jié)：厭氧菌群在虹鱒大麻哈魚的胃腸道菌群中是微不足道的一部分，因為平板計數(shù)和直接計數(shù)的評估結(jié)果是相對一致的。盡管用顯微鏡直接觀察來斷定菌群種類是不可取的，盡管結(jié)果是相似的，但是種類計數(shù)和培養(yǎng)也可能不同。一些人嘗試著從魚胃腸道中分離和特征化厭氧菌，首先被報道的是Trust 等. (1979).他們從草魚，金魚，鮒魚和虹鱒的胃腸道內(nèi)分離細菌。細菌的種類幾乎未知，其群體結(jié)構，發(fā)酵能力及與宿主間的互做關系也不清楚。厭氧菌群接著從不同淡水魚種的腸道里被分離出來(Sakata et al.1980). 此研究只是比較這些魚種里胃腸道需氧和厭氧菌的數(shù)量，而不能作為分離細菌種鑒定的依據(jù)。并且在此研究中，厭氧罐用作分離厭氧菌，但此方法不能夠分離到嚴格的厭氧菌，因為厭氧罐開始有氧，花了幾個小時才使它完全厭氧。集約化養(yǎng)殖的溝鯰的腸道微生物被檢測(VanVuren 1998).優(yōu)勢菌群的種類沒有詳細描述，但其能夠分解纖維素有利于宿主消化植物餌料。
2.胃腸道厭氧菌群 (Burr et al. 2005)
魚胃腸道厭氧的研究對于特征化宿主菌群和評估配方設計對有益菌群的積累是必要的。不使用嚴格的厭氧技術而特征化厭氧菌群的不足導致了錯誤的結(jié)論。例如, Weinstein et al.(1982)在鯛的腸道發(fā)現(xiàn)了纖維素酶的活性存在，但卻不能培養(yǎng)出纖維素酶產(chǎn)物的細菌，因此得出結(jié)論：纖維素酶的活性可能只存在于鯛體內(nèi)。盡管他們的腸道菌群采樣過程使腸內(nèi)容物在轉(zhuǎn)移導厭氧袋前暴露于氧氣中，從而嚴格厭氧菌可能會被殺死。而且，樣品被放置到干冰中 (-20°C)連續(xù)96 h,這對于大多數(shù)微生物來說也是致命的。(Atlas and Bartha 1993). Weinstein et al. (1982) 觀察到腸組織似乎是纖維素酶的來源，一旦有纖維素酶的活性腸內(nèi)容物就會變得很少。盡管如此，甚至用水清洗完胃腸道組織后，分解纖維素的細菌仍然附著在腸腔內(nèi)壁上并表現(xiàn)出纖維素酶的活性。Luczkovich and Stellwag (1993) ，隨后Stellwag et al. (1995) 發(fā)現(xiàn)掉的腸道中分解纖維素的細菌是專性厭氧菌。檢測到魚胃腸道分離出的厭氧菌的酶活是有限的。1997年，淀粉酶在五種魚（Ayu Plecoglossus altivelis, 鯉 Cyprius carpio,溝鯰,日本鰻鱺 Angullia japonica 和羅非Oreochromis niloticus）體內(nèi)被檢測到(Sugita et al. 1997). 他們發(fā)現(xiàn)淀粉酶的活性在分離出的厭氧菌中占較高的比例 (68.4%), 而需氧菌只有20%. 這就證明了胃腸道中的厭氧菌在宿主的消化功能上發(fā)揮重要作用。 Ramirez and Dixon (2003) 從星麗魚
在過去幾十年中，隨著微生物學，遺傳學與分子分類學的發(fā)展，人們已經(jīng)將關于變種的說法排除掉，在提高益生素品質(zhì)上也有很大的進展，益生素的生存能力都得到提高，因而更加適應于臨床試驗研究，因此，下一步的工作就是很好的設計一下臨床試驗研究，同時，由于這種益生素對食用動物的健康作用，許多人對發(fā)展益生素食物的巨大市場潛力很感興趣，因此，在過去的幾年中，隨著益生素研究的深入和產(chǎn)權聲明，用于益生素的臨床試驗的經(jīng)費不斷增加，國際組織也開始通過各種途徑來引導臨床試驗研究，以便更好的了解益生素對人類健康的作用，更為重要的是，這些研究正在努力得出一個關于益生素的完整而簡潔 的定義，這些工作由Dairy Managemen資助，由National Dairy Foods Research Center Program主辦。
3水產(chǎn)方面的研究
眾所周知，微生物對魚類生活起很重要得作用，例如，將zebrafish置于 微生物環(huán)境中，有212個基因低于或高于標準水平，然而這些基因的多數(shù)都直接作用于魚的免疫和營養(yǎng)功能，在過去兩年中，將益生素用作水產(chǎn)飼料來影響魚類的生長素率和健康是水產(chǎn)營養(yǎng)研究中最火爆的一個課題，關于益生素的營養(yǎng)機制的猜測有多種多樣，例如，通過產(chǎn)生抑制性復合物，競爭性的抑制病原菌，競爭營養(yǎng)和能量，競爭黏附過程，改善水質(zhì)，增強食用動物的免疫應答，通過增加消化酶來改善食用動物的營養(yǎng)狀況以及與浮游植物的交互作用。 許多研究已經(jīng)通過可能存在得商業(yè)化實體和幾個功能組成得到了證實。因此，在許多鼓舞人心得報道之后很難譯解這門學科。許多關于水產(chǎn)飼料的益生素研究只是估測了生長性能，免疫應答反應和疾病的激發(fā)。胃腸道中微生物的動力學還沒有研究。傳統(tǒng)上，這個信息已經(jīng)通過有或者沒有厭氧培養(yǎng)室的胃腸道細菌種類的培養(yǎng)中而獲得。現(xiàn)在，通過分子技術，這個研究已經(jīng)變得簡單而明確。試驗設計包括胃腸道中微生物DNA的提取，用普通的細菌引物如16SrDNA引物來技能型PCR擴增，變性梯度凝膠電泳，然后亞克隆放大的DNA到載體中，并且測序。
4、芽孢桿菌種類
芽孢桿菌種類如枯草桿菌，地衣芽孢桿菌是有芽孢的細菌。像飼料中的益生素一樣，許多國家包括歐盟已經(jīng)贊成將其運用到陸棲動物上。這些種類都存在天然水中。芽孢能夠在干燥脫水的環(huán)境中生存很長時間。他們能夠在制粒過程中（不高于60℃）幸存，因此，他們很有希望作為飼料補充料的。應該提及的是，有些研究者認為芽孢桿菌的芽孢在擠出，膨脹和干燥處理過程前不應該包括在飲食中的，因為這個過程能夠引起99％的芽孢的損失（Decamp 2004）。已經(jīng)證實在小豬和家禽的飼料中投入枯草桿菌和地衣芽孢桿菌能提高存活率（Kǖrti 2000）。虹鱒魚的一個研究表明在飼料中添加4×104芽孢/g飼料 能增加對Yesinia ruckeri的抵抗力（Raida et al. 2003）。Guelph 大學的一個沒有公布的研究表明由China Way公司（中國臺灣）生產(chǎn)的一種含有枯草桿菌的商業(yè)化產(chǎn)品生原體能顯著增強羅非魚的生長效率和飼料效率。
研究表明在烏頰魚鯛飼喂純培養(yǎng)的枯草桿菌（107CUF/g飼糧）2和3周后，而不是4周，能顯著提高吞噬能力。這個研究也表明前腎白細胞的細胞溶解活性能通過兩個周的這種補充物飼喂而得到增強。兩種功能都受給藥的時期長度的影響。那些作者解釋這是由于細菌存留的時間不足引起的（Salinas et al. 2005）。
芽孢桿菌的種類如枯草桿菌（從鯉魚腸中分離的）和環(huán)狀芽孢桿菌（從羅非魚腸中分離）也能產(chǎn)生許多的酶類，具有細胞外分解纖維素和分解淀粉的活性。一些研究表明含有這些細菌的植物飼料如銀合歡屬干菜粉在37℃下培養(yǎng)15天能顯著分解干菜粉中的粗纖維，纖維素，半纖維素，單寧酸，植酸和含羞草氨酸（Bairagi et al. 2004）。處理過的干菜粉能顯著提高消化率，胴體蛋白和印度野鯪魚的生長。這個研究證明了一種新的用細菌提高蛋白質(zhì)質(zhì)量方法（Bairagi et al. 2004）。
Toyoi桿菌，最先是從土壤中分離的，是一種能抑制胃腸中腸毒性病原體生長的芽孢成形細菌。這些細菌菌株已經(jīng)被用來作為陸生動物的日常飼料添加劑，而且，最近也被用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中。然而，Chang和Liu(2002)未能證明這種細菌的補充給藥在抵抗遲鈍愛德華菌感染中的起到的有益影響。
5、乳酸菌種類
乳酸菌包括許多種類。乳酸菌如鼠李糖乳酸桿菌已經(jīng)作為一種益生素運用到水產(chǎn)飼料中。已經(jīng)證明多種乳酸菌能通過釋放乙酸和乳酸來抑制生長或抑制魚的病原菌，而不是四方桿菌素（Vazqueaz et al. 2005）。
在鯛的飼糧中補充 Lactobacillus delbrüeckii ssp.lactis（107CFU/g飼糧），飼喂兩周后，引起烏頰魚鯛前腎粒細胞的吞噬能力顯著增加，三周或四周后增量不再顯著。這個研究也證實了在飼喂了這種補充物三周后，前腎白細胞的細胞溶解作用得到了增強。這兩種功能都受給藥時間長短的影響。作者解釋了這些影響是由于這些細菌存留時間的不足引起的（Salinas et al. 2005）。在改變?yōu)闆]有補充物飼養(yǎng)的一周內(nèi)，虹鱒魚腸中和皮膚黏液的L. rhamnosus都消失了（Nikoskelainen et al. 2003;Paniqrahi et al. 2005），這個多方面的報道與假設是一致的。Nikoskelainen et al.(2003)發(fā)現(xiàn)飼糧中L. rhamnosus的添加量在某個確定水平和給藥時間長短的條件下能增強白細胞的突發(fā)性呼吸，血清介導的大腸桿菌的死亡和血清免疫球蛋白水平。然而，這種促進作用不能支持明確的試驗設計來廣泛應用到水產(chǎn)飼料中。
運用到幼蟲培養(yǎng)的益生素如
L. delbrüeckii已經(jīng)被Camevali et al.（2006）通過測定幼蟲生長和IGF-1的mRNA轉(zhuǎn)錄物水平得到證實。Pichietti et al.(2006)第一次運用了食果糖乳桿菌（從成年烏頰魚鯛的腸中分離）和胚芽乳桿菌（從人類的排泄物中分離）豐富輪蟲和鹵蟲。他們發(fā)現(xiàn)幼蟲飼喂?jié)饪s的輪蟲和鹵蟲后，在腸相關淋巴樣組織中（GALT）有更多的顯著的Ig生成細胞和嗜酸性粒細胞。他們的發(fā)現(xiàn)指出了與幼蟲存活有關的免疫系統(tǒng)中某種益生素的促進作用。另外，一些種類如Lactococcus casei ssp. casei,乳酸片球菌，或乳酸乳桿菌spp lactis能夠增加輪蟲的產(chǎn)生（Planas et al.2004）。
6、Carnobacterium sp.
Carnobacterium divergens是從鱈魚腸中分離的一種乳酸菌。Gilberg et al.(1997,1998)用鱈魚肌肉水合物的低分子量部分在液體培養(yǎng)基中生長，然后分離，將葡萄糖、礦物質(zhì)、維生素和核苷酸包括細菌以2×109CFU/g量添加到飼料中。鱈魚飼喂這種飼糧21天，能顯著提高對哈氏弧菌的抵抗力，甚至是在腸中或體外試驗中沒有觀察到得兩種細菌的對抗作用。
理論上，抗菌素可以用來處理傳染性疾病，但是很少有人會注意到抗菌素的治療和預防的作用，最近20年，已經(jīng)有了抗菌素用于人類的健康和動物性產(chǎn)品的成功的例子，一些魚類病菌的抗生素已經(jīng)有過敘述了（WU et al.1981），但是卻很少有人會用抗生素來控制魚類的細菌感染，Park et al(2000)發(fā)現(xiàn)抗菌素對. Lactococcus garvieae鯡和其他海洋魚類的菌有特效，這說明抗生素對控制魚類的細菌感染又很大的作用。
11啤酒酵母
Lara-flores et al. (2002)在羅飛魚飼料中添加0.1％的啤酒酵母，相對于不添加的可以顯著的提高魚類的生長率。
這種酵母分是從鮭魚腸中分離來的，Tovar et al. (2002)通過在球狀飼料上噴霧，獲得了活得酵母粉，并從鱸魚幼魚剛開口就飼喂改種飼料，表明這種酵母粉可以促進海生幼魚消化器官的成熟，這種酵母菌對消化器官的有益作用是因為該種酵母菌可以分泌精胺和亞精胺，在后來的研究中還發(fā)現(xiàn)，酵母粉混合物可以提高存活率，并能降低幼魚的畸形率，在一組飼喂含有1.1％酵母粉試驗魚中只有1％的畸形率，相對的在沒有飼喂的一組的畸形率則高達14％，另外，飼喂含酵母分飼料的組的胰島素和脂肪酶的濃度和活性都要明顯高于沒有飼喂的，然而淀粉酶的活性卻降低了，這說明飼喂酵母粉的兩個組的胰腺成熟的早。腸內(nèi)的堿性磷酸酶，氨基肽酶，麥芽糖酶的活性，在飼喂1.1％酵母粉的組要明顯高于其他兩組，有利于早點開始腸內(nèi)消化，飼喂含有1.1％酵母粉的組獲得了最好的結(jié)果，不同酵母粉添加量的不同表現(xiàn)，可能是由于酵母粉在幼魚體內(nèi)分泌的多胺的數(shù)量不同造成的。
Cernivet® LBC (Cerbios-Pharma SA, Lugano, Switzerland)是一種針對于Enterococcus faecium SF68的商業(yè)產(chǎn)品。
Toyocerin® (Toyo Jozo Co. Ltd., Tokyo, Japan)是一種針對于Bacillus toyoi的商業(yè)產(chǎn)品。
Efinol® PT (Bentoli, Inc. USA)是一種商業(yè)益生素，他含有Bacillus sbutilis, B. licheniformis, B. coagulans, 乳酸菌, 鏈球菌和啤酒酵母。改產(chǎn)品可以直接投喂在池塘里或用作飼料的被膜（推薦劑量為4-7 g/kg feed），改產(chǎn)品可以延緩被病毒感染的蝦的死亡時間，可以提高總體的存活率。（Nunes 2006).
IV. 益生元 (30 min)
1. 定義
益生元由 Gibson and Roberfroid (1995)定義為一種不可消化的食物組分，它能通過刺激一種促進代謝倡導健康促進細菌的生長，使宿主獲益，從而提高宿主腸道平衡。
益生元在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的研究極為受限。Grobiotic®-A was developed by International Ingredient Corp., St. Louis, MO, USA.我們已經(jīng)用雜交鱸魚的三個分離飼養(yǎng)實驗對產(chǎn)品進行了評估。這個產(chǎn)品是種混合物--部分自溶的啤酒酵母，奶組分，曬干的發(fā)酵產(chǎn)物（35.2% 粗蛋白,1.7% 粗脂肪 and ~53% 單糖和多糖包括低聚糖）
類似的產(chǎn)品已經(jīng)顯示出對雞腸道菌群的影響，并且能夠促進雞的生長。Li and Gatlin (2004,2005) 發(fā)現(xiàn)在魚的飼料添加Grobiotic® -A 顯示出較高的采食率和細菌病原體侵害時較低的死亡率。海豚鏈球菌 and 海分枝桿菌. 盡管如此，腸道菌群也沒有被研究確定是否Grobiotic®-A 改變了它的組成.近期我們實驗室的活體外研究已經(jīng)確認紅鯛腸道菌群的改變。Sciaenopsocellatus in the presence of GroBiotic®-A based on denaturing gradient gel eletrophoresis.
Kihara et al. (1995)利用蔗糖作為腸內(nèi)微生物的基質(zhì)，發(fā)現(xiàn)紅鰭笛鯛和成年黑鯛的腸膜肌的厚度增加。但是Kihara and Sakata(2001a) and Kihara and Sakata (2001b)發(fā)現(xiàn)鯉魚和紅鱒體內(nèi)，微生物對蔗糖的利用率很低。Mahious et al. (2006)沒有觀察到在食物中添加2%的蔗糖對木葉鰈幼魚生長和有益微生物的影響。
6.
低聚異麥芽糖
低聚異麥芽糖是白聯(lián)珠菌發(fā)酵甘蔗汁的化合物。日糧中添加1%－4%能增加禽類盲腸內(nèi)的雙岐桿菌數(shù)量，在對禽類的飼料攝取量和生長性能無有害影響下，抵抗沙門氏菌。(Chuang and Day 2004; Thitaram et al. 2005)。但是這些知識不能用在水產(chǎn)動物上。
7.低聚甘露糖
低聚甘露糖來源于酵母（啤酒酵母）細胞壁，大約45%
的細胞壁含有甘露糖的殘基(Tizard et al., 1989)。凝集素甘露糖在許多腸內(nèi)病原體中占優(yōu)勢并且間接黏著在上皮的細菌中(Baumler et al., 1997)。病原菌可以粘附腸上皮細胞，低聚甘露糖通過填充來阻止病原菌的粘附。利用潛在的有害菌占據(jù)粘附位置，能降低其在腸內(nèi)的聚集。革蘭氏陰性菌通過與微生物表面的外源凝集素特異性甘露糖相互作用，利用低聚甘露糖產(chǎn)物來凝集。豬日糧中包含的低聚甘露糖通過降低致病菌(Connolly, 2001)和免疫調(diào)節(jié)(Newman, 1994; Pettigrew, 2000)，可能能夠改善豬的健康和生長狀況。狗飼料含有低聚甘露糖(P =0.05)能降低排泄物中的總需氧菌，增加(P = 0.13)乳酸菌的數(shù)量(Swanson et al. 2002)。目前尚沒有低聚甘露糖在水產(chǎn)上利用的相關報道。
比如乳酸菌(L.) plantarum，L.酵母菌，L. brevis，L. buchneri和L. reuter是一種有希望的途徑，因為在植物發(fā)酵過程中α-半乳糖苷酶(α-Gal)的活性，能水解α-半乳寡聚糖(α-GOS)為可消化的碳水化合物(LeBlanc et al. 2005)。Tzortzis et al. (2004)證明合成低聚糖能增加雙岐桿菌和乳酸桿菌的數(shù)量和大小，同時大幅度降低梭菌的數(shù)量和大小，就像商業(yè)的體外益生素（FOS，蜜二糖，棉子糖）。通過改變短鏈脂肪酸產(chǎn)生方式，比較單獨使用GMM或者GMM加上嗜酸乳酸菌，證明增加L. reuteri能增加生物效應。短鏈脂肪酸產(chǎn)生的改變與L. reuteri的發(fā)酵性質(zhì)一致，報道指出異常的合成菌對犬的腸道微生物發(fā)酵具有重要的影響。目前仍然不知道魚類是否利用半乳寡聚糖能增加胃腸道Labacillus
數(shù)量的穩(wěn)定性。
V. Synbiotics (5 min)
當Gibson引入益生元的概念時，他也推測到如果益生元和益生素以一種他稱為synbiotic 的形式化和起來，就會有額外的收益。他定義為“益生元和益生素的混合物，通過提高胃腸道活菌添加植入和存活率，及選擇性的刺激生長間或激活一種或幾種健康促進菌的新陳代謝，從而提高宿主福利，使宿主受益。這個名字就意味著益生素應該給益生元生長提供選擇優(yōu)勢，他們結(jié)合起來發(fā)揮協(xié)同作用。在此之前，對這一添加形式的科學研究數(shù)量是有限的，因此這種理論實體是否能提供除益生元和益生素單獨作用外的健康促進效應也未可知。(Teitelbaum and Walker 2002).
Synbiotics 對于水產(chǎn)養(yǎng)殖來說是一個非常新的概念。To the best of my
knowledge, this information is not available in our field.盡管有許多的內(nèi)容關于某種益生素，如水產(chǎn)動物胃腸道中的L. rhamnosus以及益生元的不調(diào)和可能引起環(huán)境中菌群的改變。深入地研究益生元對胃腸道微生物生態(tài)的影響和synbiotics 的潛在發(fā)展對于水產(chǎn)養(yǎng)殖中水產(chǎn)動物胃腸道菌群的有效管理是十分必要的。