雙連翹粉針的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究
張國(guó)紅 王剛 杜國(guó)清
（四川華西動(dòng)物藥品研究所，綿陽(yáng)高新區(qū)， 621000?。?/strong>
汪勇熊劍于飛
（四川華西動(dòng)物藥業(yè)集團(tuán)有限公司，綿陽(yáng)高新區(qū)，621000）
關(guān)鍵詞：連翹苷；高效液相色譜法；雙連翹粉針
雙連翹粉針是由連翹、雙花和板藍(lán)根三味中藥的全提取物經(jīng)科學(xué)方法精制而成，是治療傳染性胸膜肺炎、肺疫、喘氣病、葡萄球菌病、鏈球菌病、大腸桿菌病、痢疾桿菌病、肺炎球菌病、綠膿桿菌病、腦膜炎雙球菌病、結(jié)核病、乳房炎、子宮炎等細(xì)菌性疾病和流行性腹瀉、流感、圓環(huán)病毒病、藍(lán)耳病等病毒性疾病的中藥注射制劑[1,2]。具有抗菌抗病毒、利膽保肝、止咳平喘、調(diào)節(jié)免疫等作用[3]。其主藥連翹具有清熱止嘔、清利肝膽、除濕退黃、通調(diào)三焦等多種作用[4]。連翹中的主要生物活性成分連翹苷具有較強(qiáng)的抗菌作用，并能抑制CAMP磷酸二酯酶的活性[5]，故以連翹苷作為指標(biāo)成分，進(jìn)行了含量測(cè)定。
以往文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)連翹苷的測(cè)定方法有薄層色譜法[6]、梯度洗脫的RP-HPLC法[7]等。鐘品以硅膠G-4%NaAc薄層板鑒別連翹時(shí)，供試品溶液在與連翹對(duì)照藥材色譜相應(yīng)位置上顯2個(gè)顏色相同的斑點(diǎn);而陰性對(duì)照液不顯相應(yīng)主斑點(diǎn)[8]。張玲等采用雙波長(zhǎng)薄層掃描法測(cè)定青翹和老翹中連翹苷的含量，青翹中連翹苷含量為0.076%；老翹中僅為0.012%。作者認(rèn)為雙波長(zhǎng)薄層展開(kāi)及顯色系統(tǒng)測(cè)定連翹苷，方法簡(jiǎn)便、快速、靈敏度高、重現(xiàn)性好，可作為連翹藥材及含連翹制劑的質(zhì)控方法。在連翹苷提取分離中，采用氯仿進(jìn)行提取，再用水洗去氯仿提取液中水溶性雜質(zhì)，可有效地去除干擾，薄層效果較好[9]。中藥制劑中連翹苷的測(cè)定未曾報(bào)道過(guò)。王雪等用反相高效液相色譜法測(cè)定連翹生藥及銀甲婦康液等含連翹制劑中連翹苷的含量。線性范圍為0.15～1.95 μg，方法回收率為101.3%，RSD為1.3%。作者認(rèn)為該方法能消除中藥制劑中復(fù)雜組分的干擾，準(zhǔn)確地對(duì)連翹苷進(jìn)行含量測(cè)定[10]。我們用氧化鋁柱層析對(duì)樣品進(jìn)行凈化處理后，采用ODS柱、乙腈-水(22∶78)為流動(dòng)相的RP-HPLC法，能夠準(zhǔn)確地對(duì)雙連翹粉針中的連翹苷含量進(jìn)行測(cè)定，陰性對(duì)照不干擾，取得較為滿意的結(jié)果。
1 儀器與試藥
日本島津LC-6A高效液相色譜儀，SPD-6AV紫外檢測(cè)器，C-R4A數(shù)據(jù)處理機(jī)。連翹苷對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所)，雙連翹粉針(四川華西動(dòng)物藥業(yè)有限公司)。乙腈(色譜用)，重蒸餾水。
2 實(shí)驗(yàn)方法
2.1 供試品溶液的制備
2.1.1雙連翹粉針 精密稱取雙連翹粉針0.5g，加甲醇10 mL，充分?jǐn)嚢韬筮^(guò)氧化鋁柱(17 cm×2 cm，中性氧化鋁20 g)，用50%的甲醇35 mL少量多次洗脫，收集洗脫液于水浴上揮干，殘?jiān)?0%的甲醇溶解后轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，過(guò)濾，棄去初濾液，收集續(xù)濾液備用。
2.1.2雙連翹粉針陰性對(duì)照 去掉處方中的連翹全提取物后，照生產(chǎn)工藝制備得到雙連翹空白粉針（由四川華西動(dòng)物藥業(yè)有限公司提供），然后按“2.1.1”項(xiàng)的方法制備得到陰性對(duì)照液。
2.1.3連翹 取適量連翹生藥粉碎后，精密稱取生藥粉末0.5 g，加甲醇15 mL超聲提取30 min后，轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻后過(guò)濾，棄去初濾液，取續(xù)濾液備用。
2.2 連翹苷對(duì)照品溶液的配制 精密稱取連翹苷對(duì)照品25 mg，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度約為0.50 mg。mL-1的對(duì)照品貯備液。精密量取對(duì)照品貯備液15 mL于50 mL容量瓶中，用50%的甲醇稀釋到刻度，搖勻，即得濃度約為0.15mg。mL-1的對(duì)照品溶液。
2.3 色譜條件 經(jīng)試驗(yàn)后選定的色譜條件為色譜柱:Shim-Pack CLC ODS柱(150 mm×6.0 mm)，柱溫:30℃;流動(dòng)相:乙腈-水(22∶78)，流速:1.0 mL。min-1;檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm。
3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
3.1 色譜圖 在選定條件下，連翹苷對(duì)照品、銀甲婦康液、連翹以及雙連翹粉針連翹陰性對(duì)照的色譜圖見(jiàn)圖1?？梢?jiàn)，連翹苷出峰處陰性對(duì)照無(wú)干擾。
a.連翹苷對(duì)照品 b.連翹苷陰性對(duì)照c. 雙連翹粉針 d.連翹藥材
1.連翹苷(23.06 min)
3.2 線性與范圍 分別取連翹苷對(duì)照品溶液1，3，5，7，9，11，13 μL進(jìn)樣，樣品平行操作，記錄色譜圖，以峰面積對(duì)連翹苷的進(jìn)樣量X(μg)作線性回歸，得到線性方程為:A=8.446+759.6 Xr=0.9996。說(shuō)明連翹苷進(jìn)樣量在0.15～1.95 μg范圍內(nèi)線性較好。
3.3 回收試驗(yàn)
3.3.1凈化回收率 分別精密量取連翹苷對(duì)照品溶液2 mL，分別加水2 mL，照雙連翹粉針樣品預(yù)處理方法制備試驗(yàn)溶液。另精密量取同一對(duì)照品貯備液2 mL，置25 mL容量瓶中，用50%的甲醇稀釋到刻度，即得對(duì)照溶液。供試溶液和對(duì)照溶液分別進(jìn)樣10 μL，記錄色譜圖，根據(jù)所得峰面積，計(jì)算凈化回收率。平均凈化回收率為99.1%(n=6)，RSD=0.74%。說(shuō)明采用選定方法凈化樣品有很好的凈化回收率。
3.3.2加樣回收率 取雙連翹粉針空白溶液(雙連翹粉針的處方中去掉連翹，但制備工藝相同)25 mL，分別準(zhǔn)確加入一定量的連翹苷對(duì)照品，照雙連翹粉針樣品預(yù)處理方法制備得試驗(yàn)溶液。進(jìn)樣10 μL，另取連翹苷對(duì)照溶液1，3，5，7，9，11，13 μL進(jìn)樣，按標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。平均回收率為101.3%，RSD=1.3%，n=15。
表1 回收率測(cè)定結(jié)果(n=3)
| 加入量/mg | 回收率/% | RSD／% |
| 0.492 | 102.3 | 1.15 |
| 0.98 | 100.6 | 1.62 |
| 1.48 | 100.8 | 1.25 |
| 1.97 | 100.3 | 0.76 |
| 2.46 | 102.3 | 0.23 |
3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 于0，2，4，6，8，12 h取同一供試品溶液和對(duì)照品溶液各10 μL，分別進(jìn)樣2次，計(jì)算日內(nèi)RSD分別為1.11%和0.91%。再于第1，2，3，4 d分別取同一供試品溶液和對(duì)照品溶液各10 μL，進(jìn)樣2次，計(jì)算日間RSD分別為2.54%和0.84%。
3.6 進(jìn)樣精密度試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，根據(jù)峰面積值，計(jì)算得平均峰面積A=737880，RSD為0.85%。
3.7 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 照“2.1.1”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，照“2.3”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣1次，以連翹苷峰計(jì)算，測(cè)得柱效為9.2×103，連翹苷與其前后雜質(zhì)的分離度分別為8.85和5.31。
3.8 樣品測(cè)定 采用前述的樣品預(yù)處理方法和色譜條件，分別測(cè)定了5個(gè)批號(hào)的雙連翹粉針中連翹苷的含量以及連翹生藥中連翹苷含量，結(jié)果見(jiàn)表2。
表2 不同樣品中連翹苷的含量(n=3)
| 樣品 | 平均含量/mg。mL-1 | RSD/% |
| 雙連翹粉針20040315 | 0.584 | 1.11 |
| 20040326 | 0.512 | 0.15 |
| 20040407 | 0.757 | 1.19 |
| 20040428 | 0.892 | 0.42 |
| 20040509 | 0.255 | 0.61 |
| 連翹 | 0.0120(mg。mg-1) | 1.35 |
4.1我們?cè)?jīng)采用過(guò)甲醇(含1%的四氫呋喃)-水(含0.01 mol。L-1磷酸二氫鈉，pH 3.2)(40∶60)的系統(tǒng)，不同比例的乙腈-甲醇-水系統(tǒng)，以及不同比例的乙腈-水系統(tǒng)，結(jié)果表明：乙腈-水為22∶78時(shí)，連翹苷峰形對(duì)稱，分離完全，陰性對(duì)照不干擾。我們同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，乙腈比例微小的變化會(huì)較顯著地影響連翹苷的保留時(shí)間。
4.2在樣品預(yù)處理方法中，我們?cè)鴩L試采用過(guò)液液萃取法和硅膠柱作為層析柱的方法。前者由于凈化不完全，引入雜質(zhì)多而放棄。后者則會(huì)使連翹苷在柱上的保留性較強(qiáng)，不易被完全洗脫。采用中性氧化鋁柱，連翹苷能很容易地被50%甲醇洗脫，而中藥制劑中黃酮類等干擾組分能夠有效地被保留在柱上，用于以上幾個(gè)品種的預(yù)處理，凈化效果好，故確定采用氧化鋁柱。
4.3在對(duì)不同批號(hào)的雙連翹粉針中連翹苷測(cè)定時(shí)，發(fā)現(xiàn)其含量差異較大。