中藥添加劑對(duì)高溫中豬血清抗氧化功能的影響
宋小珍 毛帥 劉鳳華 王恬
（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)院 南京210095 2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 南昌330045
（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)院 南京210095 2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 南昌330045
3.北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科技系 北京102206）
隨著全球氣候的逐步變暖，夏季高溫高濕氣候給規(guī)?；B(yǎng)豬生產(chǎn)帶來(lái)的負(fù)面影響相當(dāng)嚴(yán)重。熱應(yīng)激是畜禽在外界高溫環(huán)境刺激下所出現(xiàn)的全身性非特異反應(yīng)。在熱應(yīng)激狀態(tài)下，豬體內(nèi)自由基大量產(chǎn)生，細(xì)胞膜流動(dòng)性下降，膜功能受損，對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)能力下降(Gerald Karp,2005)。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于應(yīng)激的調(diào)控，大都使用化學(xué)添加劑如電解質(zhì)、鎮(zhèn)靜劑、抗生素、維生素、微量元素等，多數(shù)是治標(biāo)不治本，且容易出現(xiàn)毒副作用和藥殘（李英哲等，2001；徐荷等，1997）。中藥添加劑是以中醫(yī)藥理論為指導(dǎo)， “以調(diào)為本，以平為期”，在組方時(shí)注重從平衡陰陽(yáng)、全面調(diào)節(jié)畜禽機(jī)體免疫力入手；且其具有獨(dú)特的天然性，毒副作用小，在調(diào)控畜禽熱應(yīng)激綜合癥上應(yīng)用前景廣闊。但目前有關(guān)中藥添加劑抗應(yīng)激的研究大多集中在對(duì)畜禽生產(chǎn)性能的影響上，有關(guān)中藥添加劑對(duì)熱應(yīng)激中機(jī)體抗氧化能力的調(diào)控作用鮮見(jiàn)報(bào)道。
超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)是機(jī)體的兩大抗氧化酶系統(tǒng)，對(duì)清除體內(nèi)過(guò)量的自由基，維持氧自由基代謝的平衡起著重要的作用；丙二醛（malondialdehyde,MDA）是脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)鏈?zhǔn)浇K止階段產(chǎn)生的小分子產(chǎn)物，其含量可以間接反映自由基的產(chǎn)生情況和機(jī)體組織細(xì)胞的脂質(zhì)過(guò)氧化程度（李繼紅等，2003）。本試驗(yàn)試圖通過(guò)觀察高溫下添加抗應(yīng)激中藥飼料添加劑，對(duì)高溫環(huán)境下豬血液中SOD、GSH-Px、MDA等一些與自由基有關(guān)的生化指標(biāo)的動(dòng)態(tài)影響，研究并探討中藥添加劑對(duì)豬的抗應(yīng)激效果及機(jī)理。
1．材料與方法1.1試驗(yàn)材料
1.1.1實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室人工氣候室。
1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：64只35日齡、體重6.50±1.05Kg的中國(guó)試驗(yàn)用小型豬（CEMP，農(nóng)大I系）, 常規(guī)免疫。購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)昌平試驗(yàn)豬場(chǎng)。
1.1.3中藥添加劑： 方1：由石膏、藿香、蒼術(shù)、黃柏按等比例組成。方2：由石膏、藿香、蒼術(shù)、黃柏按0.5：1：1：1比例組成。
1.1.4試驗(yàn)基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。
表1 基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平
原料（Ingredients） 組成/%（Comp osition） | 營(yíng)養(yǎng)成分（Nutrient levels） 含量(Content) |
| 玉米（Corn ） 52.0 | 消化能DE/(MJ·kg-1) 13.89 |
| 豆粕（Soybean meal） 13.0 | 粗蛋白CP/% 20.00 |
| 魚粉（Fish meal） 6.0 | 鈣Calcium/% 0.95 |
| 乳清粉（Whey） 6.0 | 總磷(Total Phosphorus)/% 0.70 |
| 膨化大豆（Expanded soybean）16.0 | 有效磷(Available Phosphorus)/% 0.49 |
| 小麥麩（Wheat bran） 3.0 | 賴氨酸(L-L ys)/% 1.35 |
| 預(yù)混料（Premix） 4.0 | 蛋+胱氨酸(Met + Cys)/% 0.66 |
注：4% 預(yù)混料為每千克全價(jià)料提供Cu 200mg、Fe 120mg、Zn 120mg、Mn 50mg、Co 2.0mg、Se 0.3mg、I 0.45mg、維生素A 800IU、維生素D31 800IU、維生素E 30IU、維生素B11.8mg、維生素B2 6mg、維生素B12 0.024mg、葉酸0.3mg、生物素0.44mg、煙酸3.2mg、膽堿800mg。
1.1.5主要試劑、實(shí)驗(yàn)儀器：SOD、GSH-Px、MDA測(cè)試試劑盒，南京建成有限公司。紫外－可見(jiàn)分光光度計(jì)UV-2000。
1.2 試驗(yàn)動(dòng)物分組
本試驗(yàn)采用農(nóng)大小型實(shí)驗(yàn)豬64頭，按窩別、體重相近原則分成4組，分別為常溫對(duì)照組（簡(jiǎn)稱對(duì)照組）、高溫應(yīng)激組（簡(jiǎn)稱應(yīng)激組）、中藥添加劑1組（簡(jiǎn)稱方1組）和中藥添加劑2組（簡(jiǎn)稱方2組）。每組4個(gè)重復(fù)，每重復(fù)4頭豬。
1.3 飼養(yǎng)管理
預(yù)飼期，各處理組豬的飼養(yǎng)水平、環(huán)境完全相同，試豬自由采食和飲水。正式試驗(yàn)期間，各組實(shí)驗(yàn)豬均飼養(yǎng)于人工氣候室中（對(duì)照組的飼養(yǎng)環(huán)境溫度設(shè)為23℃恒溫，應(yīng)激組和兩個(gè)中藥方劑組的飼養(yǎng)環(huán)境溫度根據(jù)前期試驗(yàn)得出的熱應(yīng)激模型設(shè)溫為26℃~40℃循環(huán)變溫，見(jiàn)圖1），各處理組的環(huán)境濕度、設(shè)置完全一致（詳見(jiàn)表2試驗(yàn)設(shè)計(jì)）。各處理基礎(chǔ)日糧完全相同，自由飲水。其中，中藥添加劑1組和2組在基礎(chǔ)日糧上按0.5%添加中藥添加劑方1和方2。
表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)
處理(treat) | 日糧(diet) | 環(huán)境溫度（environmental temperature） |
| 對(duì)照組(NTC) | 基礎(chǔ)日糧(basal diet) | 溫度(T)：23℃；濕度(H)：60%；光照度(L)：100LX |
| 應(yīng)激組(HTS) | 基礎(chǔ)日糧(basal diet) | 溫度(T)：26~40℃；濕度(H)：60%；光照度(L)：100LX |
| 方1組 (CMAΙ) | 基礎(chǔ)日糧(basal diet)+0.5％中藥添加劑1(Chinese medicine additives Ι) | 溫度(T)：26~40℃；濕度(H)：60%；光照度(L)：100LX |
| 方2組 (CMAⅡ) | 基礎(chǔ)日糧(basal diet)+0.5％中藥添加劑2(Chinese medicine additivesⅡ) | 溫度(T)：26~40℃；濕度(H)：60%；光照度(L)：100LX |
人工氣候艙溫度曲線如圖1：
圖1 人工氣候室溫度曲線
（X軸為時(shí)間0：00－22：00，Y軸為溫度0－45℃）
（X軸為時(shí)間0：00－22：00，Y軸為溫度0－45℃）
1.4 樣品采集與制備
在熱應(yīng)激正式試驗(yàn)第1、2、4、6、10天從每重復(fù)中選1只小豬（每組4只），頸靜脈采血10ml，靜置（離心）析出血清，于-20℃箱中保存?zhèn)溆谩?br /> 1.5測(cè)試指標(biāo)與方法
SOD : 羥胺法；GSH-PX：DTNB 直接法； MDA: TBA(硫代巴比妥酸)法。采用分光光度計(jì)檢測(cè)。
1.6 統(tǒng)計(jì)分析
采用SAS軟件分析平均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差，多重比較方差分析。
表3中藥添加劑對(duì)熱應(yīng)激豬血清SOD活性的影響 單位：活力單位/毫升（U/ ml）
天數(shù)（d） 處理(treat) | 1 | 2 | 4 | 6 | 10 |
| 對(duì)照組(NTC) | 50.91±0.98b | 51.51±8.19 | 52.88±5.51 | 50.48±5.18 | 50.06±5.19 |
| 應(yīng)激組(HST) | 65.06±4.57a | 44.14±3.13 | 48.98±4.58 | 53.06±2.61 | 53.83±8.07 |
| 方1組(CMAΙ) | 56.35±13.48ab | 44.82±5.04 | 49.46±3.62 | 44.78±5.08 | 54.79±6.95 |
| 方2組(CMAⅡ) | 62.76±2.96a | 51.17±5.88 | 51.69±4.41 | 50.31±4.41 | 51.74±4.67 |
由表3可知，各組試豬血清中SOD活性變化主要表現(xiàn)在應(yīng)激后第1天。與對(duì)照組相比，應(yīng)激組在第1天顯著升高，而后逐漸下降，到第10天又有所回升，但不出現(xiàn)顯著差異（p>0.05）。方1組的SOD活性與對(duì)照組和應(yīng)激組間均無(wú)顯著差異（p>0.05）。方2組的SOD活性顯著高于對(duì)照組（p<0.05），與應(yīng)激組之間無(wú)顯著差異（p>0.05）。
2.2中藥添加劑對(duì)熱應(yīng)激豬血清MDA含量的影響
表4? 中藥添加劑對(duì)熱應(yīng)激豬血清MDA含量的影響
單位： n mol/ ml
天數(shù)（d） 處理(treat) | 1 | 2 | 4 | 6 | 10 |
| 對(duì)照組(NTC) | 3.18±0.95 | 2.99±0.83 | 2.59±1.01 | 3.62±0.07b | 3.58±0.33b |
| 應(yīng)激組(HST) | 3.15±1.41 | 3.55±1.02 | 3.42±0.25 | 4.85±1.29a | 5.19±1.15a |
| 方1組(CMAΙ) | 3.33±0.97 | 2.19±1.18 | 3.09±0.87 | 4.92±0.37a | 4.28±0.41b |
| 方2組(CMAⅡ) | 2.93±0.66 | 3.46±0.48 | 3.15±0.95 | 4.13±0.10ab | 4.10±1.16b |
2.3中藥添加劑對(duì)熱應(yīng)激豬血清GSH-PX活性的影響
表5? 中藥添加劑對(duì)熱應(yīng)激豬血清GSH-PX活性的影響
單位：酶活力單位/毫升（U/ ml）
天數(shù)（d） 處理(treat) | 1 | 2 | 4 | 6 | 10 |
| 對(duì)照組(NTC) | 1259±46 | 1271±156b | 1283±411 | 1195±238b | 1151±314b |
| 應(yīng)激組(HST) | 1262±129 | 1239±96b | 1221±100 | 1681±183a | 1559±268a |
| 方1組(CMAΙ) | 1282±154 | 1616±187ab | 1406±190 | 1565±28a | 1572±255a |
| 方2組(CMAⅡ) | 1225±232 | 1799±381a | 1306±221 | 1480±177ab | 1402±82ab |
3. 討論3.1 高溫應(yīng)激對(duì)豬血清中SOD、GSH-PX活力及MDA含量的影響
本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高溫應(yīng)激后豬血清中MDA含量顯著高于常溫組，這表明高溫應(yīng)激加速了機(jī)體組織的脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程，產(chǎn)生了較多的有害物質(zhì)丙二醛（MDA）。同時(shí)，研究也發(fā)現(xiàn)試豬血清中SOD、GSH-PX活力在應(yīng)激后出現(xiàn)明顯增高，這可能是機(jī)體氧自由基大量產(chǎn)生刺激了體內(nèi)的自由基清除系統(tǒng)，一定程度上激活了機(jī)體的抗氧化酶系統(tǒng)功能。徐荷等（1997）研究熱應(yīng)激對(duì)ＳＤ大鼠 SOD 活性的影響發(fā)現(xiàn)，熱應(yīng)激后SOD活性升高，持續(xù)熱應(yīng)激后SOD活性下降。Balázs Borsiczky（2003）報(bào)道，受熱初期，隨著機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)，脂質(zhì)過(guò)氧化活動(dòng)的增強(qiáng)，自由基誘發(fā)了抗氧化酶的表達(dá)，SOD活性也隨之升高，這是機(jī)體的一種代償保護(hù)作用，但持續(xù)受熱后，SOD活性則受到抑制。本試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，應(yīng)激后期血清中SOD活性出現(xiàn)下降趨勢(shì)，但差異不顯著。許燕等（2000）也報(bào)道，應(yīng)激過(guò)程中，機(jī)體產(chǎn)生的自由基大量增加，同時(shí)機(jī)體自由基清除系統(tǒng)的活性也增高，隨著應(yīng)激時(shí)間的延長(zhǎng)，盡管清除系統(tǒng)活性增加，但仍不足以及時(shí)將大量的自由基清除織造成了機(jī)體氧化和抗氧化的失平衡，從而使細(xì)胞破壞，造成組織損傷。但本研究對(duì)血清中SOD和GSH-PX兩種抗氧化酶活性動(dòng)態(tài)分析發(fā)現(xiàn)，兩種酶的變化規(guī)律并不一致，SOD活性在前期顯著上升，后期下降；但GSH-PX活性卻在應(yīng)激后期出現(xiàn)明顯增高，其原因是否與兩者的作用機(jī)制有關(guān)，尚需要進(jìn)一步研究。
3.2 中藥添加劑對(duì)應(yīng)激狀態(tài)下豬血液抗氧化功能的影響
本研究結(jié)果顯示，與應(yīng)激組相比，添加中藥添加劑2后，豬血液中MDA含量出現(xiàn)顯著下降；同時(shí)，SOD、GSH-Px活性在應(yīng)激后期有下降趨勢(shì)，其活力值介于常溫組和高溫組之間。這說(shuō)明中藥添加劑2能增強(qiáng)機(jī)體清除自由基的能力，調(diào)控機(jī)體抗氧化酶系統(tǒng)功能，使其保持正常水平。方1組對(duì)以上指標(biāo)也有一定調(diào)控作用，但效果低于方2。這表明在調(diào)控?zé)釕?yīng)激狀態(tài)下豬血清抗氧化功能上，中藥添加劑2的效果優(yōu)于中藥添加劑1。
本試驗(yàn)中兩個(gè)中藥添加劑組成均為石膏、蒼術(shù)、黃柏和藿香等，其主要功效為清熱瀉火、燥濕健脾，解表和中，主要用于緩解動(dòng)物在夏季高溫高濕環(huán)境中出現(xiàn)的熱應(yīng)激病癥。中藥藥理研究證明，石膏屬清熱瀉火藥，善清氣分實(shí)熱，常用于肺胃大熱，高熱不退等實(shí)熱亢盛證。研究表明，生石膏可抑制發(fā)熱中樞而起解熱作用。藿香重在化濕，和中止痛，解暑。蒼術(shù)屬燥濕藥（樸世浩，1996）；黃柏具有清濕熱，瀉火毒，退虛熱的作用，以除下焦?jié)駸嶙罴眩ㄍ鹾馄妫?001）。黃柏對(duì)應(yīng)激性胃潰瘍有抑制作用且對(duì)水浸捆束小鼠SOD活性的降低有明顯的抑制作用（呂燕寧，2006）。四藥合用可通過(guò)促進(jìn)腸道分泌，抑制有害腸道菌群，清除腸道有害自由基等途徑加強(qiáng)對(duì)高溫環(huán)境下機(jī)體膜結(jié)構(gòu)和功能的保護(hù)。但方1中石膏比例較方2高。石膏的變化主要在于劑量變化導(dǎo)致君藥不同。方1以石膏為君藥，主要針對(duì)北方高溫干燥氣候，變化急驟，發(fā)自陽(yáng)明，重在清氣；方2針對(duì)南方濕熱氣候，藿香、蒼術(shù)為主，重在健脾化濕、祛濕。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)方2效果優(yōu)于方1，分析可能人工氣候室各參數(shù)設(shè)置與南方夏季高溫高濕的氣候接近有關(guān)。