畜牧人

標(biāo)題: 豬傳染病的準(zhǔn)確診斷——尋找從臨床到實(shí)驗(yàn)室的銜接 [打印本頁(yè)]

作者: dragonli97 時(shí)間: 2008-1-18 02:19
標(biāo)題: 豬傳染病的準(zhǔn)確診斷——尋找從臨床到實(shí)驗(yàn)室的銜接

豬傳染病的準(zhǔn)確診斷——尋找從臨床到實(shí)驗(yàn)室的銜接

李龍* 浙江大學(xué)動(dòng)物預(yù)防醫(yī)學(xué)研究所, 杭州，310029

章葉恩上海諾華動(dòng)物保健有限公司，上海，200031

* 現(xiàn)工作地址：Department of molecular microbiology and immunology, University of Missouri-Columbia, MO, 65203, USA

E-mail: dragonli97@hotmail.com或lilo@missouri.edu

多病原的混合感染已經(jīng)成為當(dāng)前豬傳染性疾病流行的最主要特征之一，導(dǎo)致發(fā)病率和死亡率的顯著上升，帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失，同時(shí)造成了病豬臨床癥狀的不典型，為診斷帶來(lái)了很大的難度，臨床上，我門(mén)已經(jīng)很難簡(jiǎn)單地將幾個(gè)癥狀組合起來(lái)就判定是什么疾病。例如與PRDC相關(guān)的病原包括PRRSV、肺炎支原體（Mh）、PCV-2、CSFV、鏈球菌、副豬嗜血桿菌、豬放線桿菌、巴氏桿菌等等，上述兩種以上的病原混合感染時(shí)，造成的損失大大加劇。因此在具有豐富臨床經(jīng)驗(yàn)的獸醫(yī)指導(dǎo)下，尋找有效的疾病控制措施的同時(shí)，很多時(shí)候我們需要對(duì)疾病進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室確診。如何銜接從臨床到實(shí)驗(yàn)室的過(guò)程，就顯得十分重要。經(jīng)驗(yàn)豐富的獸醫(yī)在診斷疾病的同時(shí)，能夠按照幾個(gè)大類(lèi)對(duì)可能感染的病原進(jìn)行分類(lèi)，然后針對(duì)性的采集、保存和送檢病料。然而臨床上，往往由于病料的選擇、采集方法、儲(chǔ)存和運(yùn)輸方式不正確，大致最后送到實(shí)驗(yàn)室的樣本無(wú)法進(jìn)行檢測(cè)，或?qū)е聶z測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確，最后延誤了疾病的診斷，甚至造成誤診。本文就上述工作展開(kāi)幾個(gè)原則性的討論，為臨床病料的收集和運(yùn)輸，提供一些有實(shí)際意義的建議。

一、臨床診斷
這個(gè)環(huán)節(jié)需要經(jīng)驗(yàn)豐富的獸醫(yī)來(lái)做出對(duì)疾病的初步診斷，對(duì)臨床癥狀十分典型的病例果斷地采取措施。然而，多病原的混合感染已經(jīng)十分普遍，僅憑臨床表現(xiàn)有時(shí)很難對(duì)疾病進(jìn)行準(zhǔn)確診斷。因此更為有意義的臨床診斷是在上述基礎(chǔ)上，對(duì)可能感染的幾種病原體進(jìn)行一個(gè)指向，特別是分類(lèi)細(xì)菌性、病毒性和寄生蟲(chóng)性的感染，在及時(shí)采取措施的前提下，來(lái)提示進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)室診斷；另外，臨床經(jīng)驗(yàn)并不豐富的實(shí)驗(yàn)室人員一般很難直接從送檢的病料特征上判斷可能的疾病，特別是為了運(yùn)輸方便，只是采集了部分臟器的病料。因此臨床獸醫(yī)與實(shí)驗(yàn)室人員的良好溝通、針對(duì)性地采集病料和送檢，對(duì)實(shí)驗(yàn)室的診斷有很大的幫助。
二、 實(shí)驗(yàn)室診斷
1、寄生蟲(chóng)的診斷
對(duì)寄生蟲(chóng)的實(shí)驗(yàn)室診斷相對(duì)容易，通常情況下，直接制備涂片、觸片、或者網(wǎng)篩富集后制備涂片、有時(shí)輔助以染色，通過(guò)顯微鏡觀察蟲(chóng)體就可以作出診斷。當(dāng)然，臨床診斷的指向作用的意義十分重要，一個(gè)最簡(jiǎn)單的例子，區(qū)分可能是血液還是腸道感染了寄生蟲(chóng)，是開(kāi)始制備檢查材料的前提。當(dāng)然也不排除其他的一些復(fù)雜情況。分子生物學(xué)方法（如PCR）也在很多寄生蟲(chóng)疾病的診斷中發(fā)揮了很好的作用，如弓形蟲(chóng)的診斷。
2、細(xì)菌分離鑒定
在進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定時(shí)，臨床診斷的指向作用就顯得意義重大了。因?yàn)椴煌募?xì)菌對(duì)培養(yǎng)環(huán)境、營(yíng)養(yǎng)需求是有很大差別的。比如只是為了鑒別診斷大腸桿菌和沙門(mén)氏菌，那么普通的麥康凱培養(yǎng)基就可以了；但是如果是懷疑是鏈球菌則需要血平板來(lái)培養(yǎng)；如果懷疑是副豬嗜血桿菌或豬放線桿菌，最好采用巧克力平板來(lái)分離，針對(duì)某些血清型，甚至需要加入NAD?？傊煌募?xì)菌的培養(yǎng)條件差異很大?？紤]到實(shí)驗(yàn)條件和成本、在針對(duì)同一份病料進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定時(shí)，一般不會(huì)同時(shí)使用很多種培養(yǎng)基。因此，如果臨床診斷的指向性不強(qiáng)或出現(xiàn)偏差，往往會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)室細(xì)菌分離的失敗，無(wú)法繼續(xù)診斷程序。
3、血清學(xué)和病毒檢測(cè)
目前對(duì)多種病毒性病原的血清學(xué)診斷方法已經(jīng)相對(duì)成熟，包括PRRSV、PRV、CSFV、PCV-2等等，其中以PRV的鑒別診斷最為理想。但是通常情況下，由于缺乏對(duì)流行病學(xué)和疫苗免疫背景的清晰調(diào)查，血清學(xué)診斷結(jié)果的指導(dǎo)作用往往會(huì)打折扣。因此強(qiáng)指向性的臨床診斷結(jié)果會(huì)大大有助于實(shí)驗(yàn)室結(jié)果的分析和確診。同樣的開(kāi)展病原學(xué)的診斷可以極大程度地提高實(shí)驗(yàn)室診斷的準(zhǔn)確性。如針對(duì)CSFV的抗原捕獲ELISA和PCR、針對(duì)PRV gE或gD基因設(shè)計(jì)的鑒別診斷PCR、針對(duì)PRRSV的熒光定量PCR等等。同樣的進(jìn)行病原學(xué)診斷的前提是獲得流行病學(xué)和疫苗免疫的背景資料，例如，剛剛免疫了CSFV，就采集扁桃體進(jìn)行PCR檢測(cè)CSFV，顯然是不合適的。

三、 病料的采集
在整個(gè)疾病的診斷過(guò)程中，病料采集可以說(shuō)是最簡(jiǎn)單的一個(gè)步驟，但又是銜接臨床與實(shí)驗(yàn)室的關(guān)鍵步驟，如果沒(méi)有一個(gè)指向性的臨床診斷和基微生物學(xué)知識(shí)基礎(chǔ)，很多時(shí)候會(huì)犯一些小錯(cuò)誤。
1、寄生蟲(chóng)和細(xì)菌性疾病的病料采集和運(yùn)送
一個(gè)強(qiáng)烈的建議：針對(duì)寄生蟲(chóng)和細(xì)菌分離鑒定的病料，只要條件允許最好直接送檢活豬。當(dāng)然如果條件不允許，也要送檢完整的臟器系統(tǒng)，如整個(gè)的肝臟、整個(gè)的心臟、整個(gè)的脾臟，上述條件對(duì)保證樣品在送檢過(guò)程中不被污染是至關(guān)重要。送檢的動(dòng)物或者用于采集病料的動(dòng)物，最好在送檢前1周，停止使用所有抗寄生蟲(chóng)藥物和抗生素，這樣能夠讓關(guān)鍵的致病寄生蟲(chóng)或者細(xì)菌得以大量繁殖，有利于下一步的病原分離。同樣的，選取的送檢動(dòng)物最好是那些將死未死的發(fā)病動(dòng)物，原因同上。
一個(gè)必須滿足的條件：上述用途的病料一定要新鮮?。?！所謂新鮮，一個(gè)簡(jiǎn)單的解釋就是不能冷凍和腐敗。如果將病料冷凍處理，由于細(xì)胞內(nèi)形成冰晶，細(xì)胞膜被刺破，在下次解凍時(shí)，寄生蟲(chóng)和細(xì)菌就死亡了，進(jìn)一步的分離也就中斷了。如果是腐敗的病料，那么病料中含有的最多的細(xì)菌就不是疾病相關(guān)的了，而是腐敗相關(guān)的細(xì)菌，這顯然會(huì)大大影響分離的結(jié)果。那么如何在運(yùn)送過(guò)程中保證病料的新鮮呢？這對(duì)于活體運(yùn)送，沒(méi)有問(wèn)題。但是運(yùn)送臟器病料就需要采取一些必要的措施，一個(gè)簡(jiǎn)單的方法是，將病料按不同臟器或者不同動(dòng)物的所有臟器，以保鮮袋分開(kāi)包裝編號(hào)后，置于泡沫保溫箱中，然后放入足夠的冰塊（礦泉水瓶灌水冷凍即可），保證整個(gè)運(yùn)送過(guò)程中病料處于新鮮狀態(tài)。
在完成了上述步驟后，就是實(shí)驗(yàn)室的工作的了。在這里只是簡(jiǎn)單地描述一下。寄生蟲(chóng)的分離和觀察，比較簡(jiǎn)單，但是需要豐富的經(jīng)驗(yàn)。細(xì)菌的分離相對(duì)復(fù)雜，特別是往往一次能從病料中分離到很多種細(xì)菌和霉菌，甚至長(zhǎng)了滿滿的一個(gè)平板，如何從這些菌落中挑出與疾病密切相關(guān)的菌落，然后針對(duì)性地進(jìn)行生化試驗(yàn)，并非易事，這需要扎實(shí)的理論功底、豐富的實(shí)驗(yàn)技能和臨床經(jīng)驗(yàn)，當(dāng)然先進(jìn)的自動(dòng)細(xì)菌測(cè)定系統(tǒng)，大大簡(jiǎn)化了上述步驟。
當(dāng)然，如果是采用諸如PCR的方法來(lái)診斷，冷凍病料也同樣可以使用，但是往往結(jié)果不理想。采用純化后的細(xì)菌制備模板，進(jìn)行PCR診斷，更容易得到準(zhǔn)確的結(jié)果。另外，純化的細(xì)菌可以進(jìn)行進(jìn)一步的藥敏試驗(yàn)，指導(dǎo)臨床用藥。
2、病毒性疾病的病料采集和運(yùn)送
因?yàn)椴《静⒉粫?huì)因?yàn)橛邢薮蔚膬鋈诙劳?，因此可以冷凍的方式運(yùn)送病料，這幾乎不影響病毒的分離和檢測(cè)。用于病毒性病原的診斷方法有很多，如間接免疫熒光試驗(yàn)、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、基因探針、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）等等。對(duì)于常規(guī)的一些病毒病原，PCR方法已經(jīng)十分成熟，大多數(shù)的實(shí)驗(yàn)室也是采用這種方法進(jìn)行檢測(cè)的，從這個(gè)意義上講，冷凍病料對(duì)于病毒病原的診斷沒(méi)有任何影響，同時(shí)，因?yàn)橛糜谶@樣運(yùn)送的病料在采集時(shí)并不在乎細(xì)菌的污染，采集程序比較簡(jiǎn)單，只要切取相應(yīng)的臟器組織的一部分就可以了。當(dāng)然對(duì)于不同的病原，采集的臟器是不同的。淋巴結(jié)和其他免疫器官，通常是病料采集的首選器官。如檢測(cè)CSFV最好采用扁桃體，檢測(cè)PRRSV采用肺門(mén)淋巴結(jié)會(huì)好一些。這里需要指出的是，對(duì)于很對(duì)引起流產(chǎn)的病毒，我們很容易想到直接送檢流產(chǎn)胎兒，但是很多時(shí)候這個(gè)選擇并不理想，如PRRSV的檢測(cè)，在實(shí)驗(yàn)中，我們就曾有多次不能從流產(chǎn)胎兒中檢測(cè)到PRRSV，而可以從流產(chǎn)母豬體內(nèi)檢測(cè)到的例子。
3、血清學(xué)樣品的采集和運(yùn)送
抽血的方法，每個(gè)豬場(chǎng)都有自己的一套，總的只要把握一個(gè)原則，采集的血液盡量不受污染。其實(shí)用于檢測(cè)的血清量并不需要太多，大約1ml血液析出的血清已經(jīng)足夠。一個(gè)建議是，用一次性注射器采血，采集了大約1ml后，稍稍抽出滑塞，然后套回針頭套，室溫下呈30度傾斜放置，待血液凝集后運(yùn)送，最好在24小時(shí)內(nèi)送達(dá)檢測(cè)單位。有條件的豬場(chǎng)，也可以自己分離血清后保存或送檢。

總之，強(qiáng)指向性的臨床診斷和針對(duì)性的實(shí)驗(yàn)室檢查的結(jié)合，可以大大幫助疾病的診斷和控制。以合適的方法，采集合適的病料，并以正確的方法運(yùn)送，是實(shí)現(xiàn)正確診斷的必要條件。

作者: bbbbbaaaaa88 時(shí)間: 2008-1-24 01:10
太好了
好資料:wulai: :wulai: :wulai:

作者: 許小紅 時(shí)間: 2008-1-24 06:31
感謝樓主分享實(shí)用資料！??！

作者: dragonli97 時(shí)間: 2008-1-24 11:40
不用客氣，謝謝兩位對(duì)我的文章的認(rèn)同，爭(zhēng)取再多寫(xiě)一些。

作者: binwang 時(shí)間: 2010-8-19 11:28
理論實(shí)踐的結(jié)合，實(shí)驗(yàn)和臨床的結(jié)合，是我們中國(guó)獸醫(yī)努力的方向！

作者: wangliguo429 時(shí)間: 2010-8-19 12:10
好資料，謝樓主，辛苦

歡迎光臨畜牧人 (http://m.ffers.com.cn/)