畜牧人

標(biāo)題: 反芻動(dòng)物氨基酸需要量及理想模式的研究進(jìn)展 [打印本頁]

作者: shifuming2007 時(shí)間: 2008-2-14 17:19
標(biāo)題: 反芻動(dòng)物氨基酸需要量及理想模式的研究進(jìn)展

反芻動(dòng)物氨基酸需要量及理想模式的研究進(jìn)展

趙發(fā)盛林英庭

（萊陽農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院山東青島 266109）

摘要：近年來，隨著反芻動(dòng)物營養(yǎng)研究方法和手段的不斷改進(jìn)，反芻動(dòng)物氨基酸的研究取得了很大的進(jìn)展。本文簡要論述了反芻動(dòng)物限制性氨基酸的研究現(xiàn)狀，描述了反芻動(dòng)物小腸的理想氨基酸模式的研究進(jìn)展。
關(guān)鍵詞：反芻動(dòng)物限制性氨基酸理想氨基酸模式

The Research Progress of the Ruminant Amino Acid Requirement and Ideal Pattern

Abstract: Inrecent years, The ruminant amino acid research has made obviousprogress with the development of the ruminant nutrition researchmethods. This article briefly elaborated the present situation inresearch of the ruminant restrictive amino acid, and described theresearching progress of the ruminant small intestine ideal amino acidpattern.

Keywords: Ruminant Restrictive amino acid Ideal amino acid pattern

反芻動(dòng)物能夠消化利用低質(zhì)粗飼料，但對含氮物質(zhì)利用率偏低，從而降低了日糧整體利用效率，也就是說日糧中大量的蛋白質(zhì)并沒有轉(zhuǎn)化為人類所需求的蛋白產(chǎn)品。隨著世界蛋白質(zhì)飼料資源緊缺的加劇和人類對畜產(chǎn)品質(zhì)量和環(huán)境保護(hù)要求的提高，反芻動(dòng)物營養(yǎng)研究者和畜牧業(yè)生產(chǎn)者面臨著提高動(dòng)物生產(chǎn)能力、改善畜產(chǎn)品品質(zhì)和降低日糧成本、減少動(dòng)物糞尿中氨氮排放的雙重任務(wù)。這也是近年來反芻動(dòng)物蛋白質(zhì)（氨基酸）營養(yǎng)研究的熱點(diǎn)和生產(chǎn)者所追求的目標(biāo)。為此人們圍繞反芻動(dòng)物蛋白質(zhì)和氨基酸代謝進(jìn)行了大量的研究工作，并取得了很大的進(jìn)展[1][2]。
隨著氨基酸分析技術(shù)和發(fā)酵提取、化學(xué)合成晶體氨基酸方法的飛速發(fā)展，對氨基酸營養(yǎng)作用的研究已從單純研究各種必需氨基酸需要量深入到綜合考慮各種氨基酸的平衡與模式上來。理想氨基酸模式(Ideal Amino Acid Pattern)是指飼糧中各種氨基酸的最佳平衡。在蛋白質(zhì)營養(yǎng)中，氨基酸平衡已在畜禽生產(chǎn)中得到應(yīng)用。理想氨基酸模式作為評定畜禽飼糧蛋白質(zhì)營養(yǎng)價(jià)值的重要方面，也已越來越得到人們的重視[3]。
1 反芻動(dòng)物小腸可吸收氨基酸的來源
目前，對反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)蛋白質(zhì)消化和代謝的途徑已基本摸清，但對一些氨基酸具體的代謝途徑和特點(diǎn)仍在繼續(xù)研究中[4]。反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)棲居著大量的微生物，包括細(xì)菌、原蟲和真菌。一般認(rèn)為，飼料蛋白質(zhì)進(jìn)入瘤胃后，一部分被微生物降解為寡肽、氨基酸和氨，瘤胃微生物再利用發(fā)酵生成的VFA作為碳架，并利用瘤胃發(fā)酵釋放的能量（ATP），將這部分寡肽、氨基酸和氨連同內(nèi)源分泌的氨一起又合成微生物蛋白。這些微生物蛋白連同飼料中非降解蛋白（包括過瘤胃完整蛋白和部分小肽）隨食糜流通進(jìn)入真胃和小腸，然后又被動(dòng)物分泌的消化液（酶）分解成小肽或游離氨基酸，供動(dòng)物機(jī)體利用[5][6]。
反芻動(dòng)物小腸可吸收氨基酸來源于3個(gè)部分，即瘤胃微生物蛋白質(zhì)、飼料非降解蛋白質(zhì)（包括小肽）和內(nèi)源分泌的蛋白質(zhì)[7]。微生物蛋白質(zhì)是小腸吸收氨基酸的主要來源，奶牛占35%-60%( Clark等，1992)[8]，綿羊占60%-90%(Smith，1975)。瘤胃微生物的氨基酸模式與牛奶蛋白質(zhì)中的相似，但Met, His, Leu,Val稍低。此外，微生物氨基酸到達(dá)十二指腸的量對于滿足高產(chǎn)奶牛是不夠的(Stern等，1994)[9]。 Met已經(jīng)被認(rèn)為是瘤胃菌體蛋白質(zhì)的第一限制性氨基酸，牛和綿羊飼喂的是半純合日糧或包含少量UDP日糧，Met和Lys已經(jīng)被認(rèn)為是第一和第二限制性氨基酸(Richardson和Hatfield， 1978；Storm和Orskov，1984；Titgemeyer和Merchen，1990)[7] [26][10]。不同氮源對反芻動(dòng)物的瘤胃MCP的產(chǎn)量有一定的影響，但MCP的氨基酸組成是否恒定一直引起人們的爭議。Erasmus等(1994)用不同實(shí)驗(yàn)日糧測得瘤胃細(xì)菌的氨基酸組成有一定的差異[11]，王洪榮(1998)應(yīng)用豆餅、亞麻餅和血粉3種不同氮源研究發(fā)現(xiàn)，3種氮源日糧對綿羊瘤胃微生物中的多數(shù)氨基酸無顯著影響，但從表觀數(shù)值上分析，豆餅日糧和亞麻餅日糧下瘤胃分離微生物的氨基酸組成相近，飼喂血粉日糧綿羊瘤胃微生物中His, Leu, Val, Tyr, Pro比例降低[12]?？梢姡煌慈占Z對瘤胃微生物中某些氨基酸的比例有一定影響，不同日糧下微生物氮中氨基酸氮含量間有差異。其變化原因可能是因日糧不同引起進(jìn)入小腸的微生物種類的不同所致，因?yàn)榱鑫讣?xì)菌和原蟲的氨基酸組成有一定的差異。由于日糧的不同會(huì)引起微生物的組成和種屬的差異，所以進(jìn)入小腸的氨基酸組成也有一定的不同。如果要使反芻動(dòng)物以最佳狀態(tài)生長發(fā)育，單單只由瘤胃微生物來提供氨基酸是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，因此，添加外源性AA是使反芻動(dòng)物發(fā)揮最大生產(chǎn)性能的必要前提[7]。要提高腸道內(nèi)可吸收AA的數(shù)量和質(zhì)量有多種方法，如采用一些物理、化學(xué)方法提高瘤胃非降解蛋白質(zhì)(Crooker 1986,Egil 1999 )[13][14]，但是，這并不能確保限制性氨基酸能得到滿足。要從根本上解決這一問題就要必須確切了解反芻動(dòng)物限制性AA的種類和限制順序，掌握小腸中理想氨基酸的模式以及各種氨基酸在小腸中的吸收利用率，然后通過調(diào)整日糧的結(jié)構(gòu)來達(dá)到調(diào)節(jié)進(jìn)入小腸的AA的數(shù)量和質(zhì)量均符合理想AA的組成要求[15]。當(dāng)今，許多單胃動(dòng)物都有了明確的蛋白質(zhì)和AA需要量的規(guī)定，而反芻動(dòng)物只有蛋白質(zhì)需要量，AA需要量至今尚未明確。因此，這成為當(dāng)前國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)問題。
2反芻動(dòng)物限制性氨基酸(LAA)研究現(xiàn)狀
限制性氨基酸(LAA)及其組成模式是決定反芻動(dòng)物體內(nèi)含氮物質(zhì)利用的重要因素。通過對可吸收LAA平衡調(diào)控可降低日糧蛋白用量，提高利用率，從而節(jié)約資源并能減少環(huán)境污染。AA吸收效率、轉(zhuǎn)運(yùn)效率、吸收與排出比例是評定LAA順序的基本方法（NRC 2001)。在此基礎(chǔ)上，許多學(xué)者結(jié)合飼養(yǎng)試驗(yàn)，十二指腸(真胃)AA灌注法和多血管瘺技術(shù)[16]初步建立了LAA體系，并一致認(rèn)為Lys和Met是反芻動(dòng)物的第一和第二LAA，而對其余AA限制性順序，學(xué)術(shù)界仍存在爭議。王洪榮(1998)評定了3種蛋白質(zhì)飼料的不同LAA順序[12]。Greenwood和Tigemeyer (2000)認(rèn)為生長牛的LAA順序?yàn)?/font>Lys，Met，Thr[17]。McCuistion (2004)認(rèn)為生長牛的LAA順序?yàn)?/font>Lys，Met，His。董曉玲(2003)研究了內(nèi)蒙古絨山羊的LAA，根據(jù)氮沉積求出各種AA的相對限制性順序依次為：His (20.45%)；Met (29.07%0)；Arg（51.76%)；Ser (54.25%)；Cys (72.17%)。內(nèi)蒙古絨山羊的LAA為Met和His[18]。然而甄玉國(2004)認(rèn)為Met不是影響羊絨生長的主要LAA[19]。對于LAA對反芻動(dòng)物生產(chǎn)性能的影響，也存在爭議。有研究表明，灌注或飼喂瘤胃保護(hù)性LAA 可提高泌乳量和改善乳成分(Harrison等2000；Robinson等2000)。但Bernard等(2004)認(rèn)為補(bǔ)充瘤胃保護(hù)性LAA對乳產(chǎn)量無影響。NRC (2001)總結(jié)了大量研究表明：①乳蛋白含量比產(chǎn)奶量對補(bǔ)充Lvs和Met的反應(yīng)更敏感，尤其是產(chǎn)奶高峰期以后的奶牛。②乳蛋白含量的增加與產(chǎn)奶量無關(guān)。③酪蛋白是乳蛋白中最受影響的部分。④當(dāng)可代謝蛋白中其它AA達(dá)到或接近估測需要量時(shí)，乳蛋白增加對添加Lvs和Met反應(yīng)最敏感。⑤在產(chǎn)奶量方面，泌乳早期奶牛比中期和晚期對Lys和Met敏感。王洪榮和董曉玲(2004)闡述了一些評價(jià)LAA的新指標(biāo)，如分子生物學(xué)指標(biāo)，尿中3—甲基組氨酸（MMH)肌苷比值，限制性氨基酸指數(shù)(LAAI)，蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)等[20]。
3 反芻動(dòng)物氨基酸的需要量及研究方法
近年來，理想氨基酸平衡模式已在豬禽日糧配合中得到廣泛的應(yīng)用，降低了日糧中蛋白質(zhì)的用量，提高了飼料的利用效率。但與此相比，反芻動(dòng)物的氨基酸需要量的研究顯得相對滯后。其主要原因是由于反芻動(dòng)物瘤胃微生物對進(jìn)入真胃和小腸的氨基酸組成和數(shù)量具有較大的干擾。另外，我們不能用純蛋白質(zhì)或氨基酸日糧來做平衡飼養(yǎng)試驗(yàn)，加之反芻動(dòng)物日糧的組成變化極大，很難評估其生物學(xué)價(jià)值。致使飼養(yǎng)者無法用日糧原料中氨基酸模式配合反芻動(dòng)物日糧[21][22]。
隨著瘺管技術(shù)、灌注技術(shù)、血插管技術(shù)和同位素示蹤技術(shù)等反芻動(dòng)物營養(yǎng)研究手段的發(fā)展，為反芻動(dòng)物氨基酸平衡模式的研究提供了有利的工具；同時(shí)在反芻動(dòng)物對養(yǎng)分的吸收、代謝和分配等方面也取得重大的突破。尤其是盧德勛(1997）提出了總代謝氨基酸的新概念（即由前胃和腸道吸收進(jìn)入肝臟門靜脈血液的肽和氨基酸的總量），第一次將瘤胃和腸道吸收聯(lián)系起來，能夠更精細(xì)地反映整個(gè)機(jī)體的代謝蛋白質(zhì)，可作為蛋白質(zhì)和氨基酸營養(yǎng)整體優(yōu)化的較為理想的指標(biāo)[1]，為反芻動(dòng)物氨基酸需要量的確立提供理論基礎(chǔ)[23]。
反芻動(dòng)物氨基酸需要量的研究方法主要包括以下幾個(gè)方面：
3.1 飼喂?jié)M足生產(chǎn)需要的日糧時(shí)，根據(jù)真胃或小腸的氨基酸流量和組成分析氨基酸需要量
Goedeken等(1990)分別計(jì)算了給閹牛飼喂十種不同日糧時(shí)小腸的必需氨基酸流量和組成，這些日糧具有相同的基礎(chǔ)成分和不同的蛋白質(zhì)補(bǔ)充料，均使動(dòng)物實(shí)現(xiàn)了最大生產(chǎn)性能[24]。Willkerson等(1993)根據(jù)這些小腸的必需氨基酸流量數(shù)據(jù)，分析各種必需氨基酸的變異系數(shù)，認(rèn)為變異系數(shù)最小的蛋氨酸為第一限制性氨基酸，并估計(jì)其需要量為11. 9克/天[25]。
3.2 屠體分析法
Block等(1994)注意到營養(yǎng)價(jià)值高的蛋白質(zhì)在必需氨基酸組成上與采食該種蛋白質(zhì)的動(dòng)物的必需氨基酸組成大體相似，于是提出了生長動(dòng)物的必需氨基酸需要量由體蛋白質(zhì)的必需氨基酸組成來確定的理論，但由于各組織器官必需氨基酸組成差異很大，需要用整個(gè)動(dòng)物體的氨基酸組成模式進(jìn)行預(yù)測。Hogen(1974)[26], McCance和Widdowson (1978), Evans和Patterson(1986)分析了肉牛選定肌肉組織的EAA組成模式。另外一些研究(Williams， 1978；Rohr和Lebzien，1991；Ainslie等，1993)用空腹動(dòng)物體得出了肉牛用于維持和增重的必需氨基酸凈需要量的組成模式

3.3 真胃或十二指腸梯度灌注測定法

氨基酸梯度灌注測定法是應(yīng)用最多的一種測定反芻動(dòng)物氨基酸需要量的方法。采用該方法需要給肉牛裝上真胃或十二指腸瘺管，使待測氨基酸成為第一限制性氨基酸，保證其它營養(yǎng)物質(zhì)和必需氨基酸充足且相對平衡。常用的方法有基礎(chǔ)日糧十待測氨基酸法；半純合日糧+氨基酸混合物十待測氨基酸法[27]。
3.4 真胃或十二指腸回撤灌注法
Storm和Orskov (1984)提出了一種新的灌注方法來確定某種已知氨基酸組成模式的蛋白質(zhì)中EAA的限制順序和限制程度，并根據(jù)EAA的限制程度來確定可吸收EAA的理想模式。該方法分為以下幾步進(jìn)行: (1)估計(jì)某給定蛋白的可吸收氨基酸利用效率(U)；(2)測定小腸基礎(chǔ)氨基酸流量及相應(yīng)氮平衡(NB)值；(3)按小腸基礎(chǔ)氨基酸流量中EAA的模式來配合EAA混合液，每種EAA的量均為基礎(chǔ)流量的 (1-U) /U，從真胃灌注混合液，并測定相應(yīng)的NB值；(4)每次撤出混合液中的一種EAA,同時(shí)測定NB，根據(jù)測定的NB可以確定EAA的限制順序和限制程度，由限制程度即可確定各種限制性EAA在小腸基礎(chǔ)流量中應(yīng)該補(bǔ)充的數(shù)量。Storm和Orskov(I984)用此方法測定了MCP作為綿羊的唯一蛋白源時(shí)EAA的限制情況[28]。Fraser等(1991)用此方法測定了泌乳奶牛的可吸收EAA理想模式。Greenwood等(2000)對以谷殼為基礎(chǔ)日糧、體重200千克左右的荷斯坦肉牛用真胃回撤灌注法進(jìn)行試驗(yàn)，表明蛋氨酸是第一限制性氨基酸，其需要量為10克/天[17]。
4 理想氨基酸(ldeal Amino Acid,lAA)模型及氨基酸平衡理論研究進(jìn)展
影響蛋白質(zhì)利用效率最重要的因素是小腸可消化AA模型，但由于瘤胃微生物對飼料的降解，影響了IAA模型在飼料配制過程中的應(yīng)用(Boisen等2000)。近幾年來，隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)在動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)中的應(yīng)用，研究者可通過更為復(fù)雜的數(shù)學(xué)模型來評估反芻動(dòng)物IAA模型及AA平衡。瘺管術(shù)、灌注營養(yǎng)技術(shù)和多血管瘺技術(shù)等又為反芻動(dòng)物 AA平衡模式研究提供了重要工具。王洪榮(1998)研究發(fā)現(xiàn)改進(jìn)肌肉模式為生長綿羊小腸可消化IAA模式(M85+C15)，即Lys 100% ，Met+Cys 39.37%，Thr 76.17%，His 40.51% ，Arg 72.25%，Leu 157.54% ，Ile 81.47%，Val 104.75% ，Phe 81.02%和Trp 12.94% ，EAA：NEAA 為1：1.01[12]。甄玉國(2002)認(rèn)為在AA不平衡條件下，增加蛋白質(zhì)水平實(shí)際上是對AA不平衡的一種補(bǔ)償，但這種補(bǔ)償是有限的。過度的補(bǔ)償對蛋白質(zhì)資源是一種浪費(fèi)，同時(shí)也達(dá)不到理想的增絨效果。AA平衡以后可增加外周組織，尤其是皮膚對蛋氨酸的利用，從前胃以內(nèi)源形式進(jìn)入十二指腸的Met數(shù)量減少，提高了皮膚蛋白合成量，促進(jìn)絨毛纖維生長。研究同時(shí)表明，在一定范圍內(nèi)動(dòng)物機(jī)體可通過自我穩(wěn)衡調(diào)控功能，調(diào)節(jié)血液循環(huán)中的AA趨于平衡。一旦超出動(dòng)物本身調(diào)控范圍，某些AA在血液循環(huán)中大量滯留，反而會(huì)影響AA平衡性。同時(shí)也說明，小腸可吸收IAA模式是一個(gè)范圍，在這一個(gè)理想模式范圍內(nèi)，動(dòng)物借助機(jī)體的自我調(diào)控功能，使進(jìn)人組織代謝層次的AA模式趨于理想平衡模式(盧德勛,2004)。為此，甄玉國引入氨基酸平衡指數(shù)(Amino Acid Glance Index，AABI)概念，用以評價(jià)小腸可吸收AA平衡性。甄玉國研究得出的絨山羊小腸可吸收IAA模式與王洪榮所確立的綿羊IAA模式相比，絨山羊含硫氨基酸(SAA)的比例約為綿羊的2倍，Leu和Ile明顯低于綿羊，其它氨基酸則差異不大[19]。由于內(nèi)臟組織消耗了大量的Leu,當(dāng)根據(jù)肌肉和絨毛模式計(jì)算IAA模式時(shí)低估了Leu的實(shí)際需要，因此在甄玉國研究所確定的IAA模式的前提下應(yīng)該適量提高Leu添加量同時(shí)也應(yīng)該增加Ile和Ser比例。蘇鵬程等(2004)采用同樣方法，測定了內(nèi)蒙古白絨山羊小腸AA表觀消化率，并對AA平衡性進(jìn)行評定，結(jié)果表明:玉米一豆粕型日糧條件下，小腸可吸收AABI為0.69 ，要達(dá)到M85+C15的平衡模式，需要補(bǔ)充Met、Arg、His、Thr、Ser和Trp[29]。
但人們對畜禽理想蛋白氨基酸模式的研究都是基于如下假設(shè)：即對某種動(dòng)物而言,其理想蛋白氨基酸模式相對恒定，受品種、性別、年齡等因素的影響很?。浑S著動(dòng)物的生長，改變的只是各種氨基酸的絕對需要量，而其相互比例則基本保持不變。對理想蛋白氨基酸模式的這種假設(shè)既有利于從大局上把握動(dòng)物復(fù)雜生理需要的總體動(dòng)態(tài)，也便于生產(chǎn)實(shí)踐中的運(yùn)用。但是,許多研究者證實(shí)，在以上條件下所測得的理想蛋白氨基酸模式只是相對的，品種、性別、年齡、飼養(yǎng)水平等的不同均對理想蛋白氨基酸模式有一定的影響。維持和生長在不同的情況下氨基酸的相對比例并不恒定。對不同生長狀況的畜禽，應(yīng)根據(jù)其維持和生長相對氨基酸的比例的不同，對理想蛋白氨基酸模式作適當(dāng)調(diào)整[30]。
5 小結(jié)

近年來，在反芻動(dòng)物氨基酸營養(yǎng)研究和應(yīng)用方面已取得了相當(dāng)?shù)倪M(jìn)展，但多局限于某一方面或停留在通過胃腸道和血液直接灌注等試驗(yàn)研究水平，距離真正意義上的氨基酸平衡應(yīng)用還有相當(dāng)?shù)囊欢温烦?，許多研究工作有待完善和深入，如小腸氨基酸吸收、利用和周轉(zhuǎn)機(jī)制的研究；肝臟氨基酸代謝規(guī)律及與葡萄糖代謝的關(guān)系；肽在氨基酸營養(yǎng)中的作用;外周組織氨基酸分配規(guī)律等[1]。通過日糧手段對氨基酸平衡進(jìn)行調(diào)控也有很多研究工作要做，如各種飼料瘤胃降解率和各部分氨基酸組成的數(shù)據(jù)庫的建立；微生物蛋白質(zhì)和小腸氨基酸供應(yīng)預(yù)測模型的完善；動(dòng)物不同種類和生理狀態(tài)下氨基酸需要量和理想氨基酸模式的確定等[2]。根據(jù)特定生理狀態(tài)下動(dòng)物的氨基酸需要模式，針對微生物蛋白質(zhì)和過瘤胃蛋白質(zhì)可進(jìn)行初步調(diào)控，估測初調(diào)后小腸氨基酸的供應(yīng)和模式，找出相應(yīng)的限制性氨基酸，最后再利用過瘤胃保護(hù)氨基酸進(jìn)行調(diào)控，以最終達(dá)到理想的氨基酸平衡模式[4]。
理想氨基酸模式能從一種理論發(fā)展成為一門技術(shù)，并在生產(chǎn)中得以應(yīng)用，主要原因就在于生產(chǎn)中使用理想氨基酸模式，不僅使動(dòng)物進(jìn)食的氮有最大量的沉積，減少了飼料的浪費(fèi)和環(huán)境污染，充分發(fā)揮了動(dòng)物的生長潛力，而且在改變?nèi)占Z組成的情況下仍可使蛋白質(zhì)的質(zhì)量保持恒定，從而可使動(dòng)物的生產(chǎn)性能達(dá)到預(yù)期的要求。因此，隨著營養(yǎng)科學(xué)及氨基酸發(fā)酵工業(yè)的發(fā)展，限制性氨基酸的商業(yè)化供應(yīng)量不斷增加和理想蛋白質(zhì)研究不斷深入，理想氨基酸模式將廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)中，并發(fā)揮其更大的作用。

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[ 本帖最后由 shifuming2007 于 2008-2-14 20:22 編輯 ]

作者: sunny_ly01 時(shí)間: 2008-2-14 18:49
正宗的科研論文，好東西頂一下?。。?hr noshade size="2" width="100%" color="#808080"> 作者: sdkxt2007 時(shí)間: 2008-2-14 22:45
好東西，頂一下

作者: 楊春陽 時(shí)間: 2008-2-28 10:30
標(biāo)題: 呵呵
很好的啊，林英庭老師，母校。好東西

作者: daijun7799 時(shí)間: 2008-2-28 13:49
反芻動(dòng)物蛋白營養(yǎng)應(yīng)該研究 :huahua:

作者: libingzhi521 時(shí)間: 2008-3-4 14:49
很后悔，那時(shí)沒有好好的聽聽林老師的課。呵呵睡覺了。書到用時(shí)方痕少啊

作者: hjf8112 時(shí)間: 2008-4-18 14:37
樓主厚道?。?！

作者: 石為玉 時(shí)間: 2009-7-13 14:43
當(dāng)年不注重林老師的課！太遺憾了！頂?。。。。。。?！1

作者: zuoyongxing 時(shí)間: 2009-12-2 20:29
學(xué)點(diǎn)知識(shí)

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