| 動物疫病實驗室檢驗采樣方法 | ||||
NY/T 541—2002 前言 動物病料樣品的采集是動物疾病診斷、流行病學(xué)調(diào)查或免疫監(jiān)測所不可缺少的重要步驟，在各國的獸醫(yī)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)中都把這一部分納入第一重要內(nèi)容，廣泛應(yīng)用于動物疾病流行病學(xué)調(diào)查、動物檢疫和科研教學(xué)。世界動物衛(wèi)生組織[World Organization for Animal Health(英)，Office Intentional des Epizootic(法)，OIE]推薦的診斷方法中，也將該部分內(nèi)容列為第一部分內(nèi)容。 本標(biāo)準(zhǔn)是依據(jù)世界動物衛(wèi)生組織(OIE)《診斷試驗和疫苗標(biāo)準(zhǔn)手冊》(2000版)(Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines ，2000)第1·1.1章"Sampling Methods"的技術(shù)要求編寫的。本標(biāo)準(zhǔn)與該章的非原則性差異在于: ——本標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合本國實踐經(jīng)驗對操作程序和條件作了更具體的陳述和規(guī)定； ——本標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)GB/T1.1-2000的規(guī)定和漢語習(xí)慣將該章的陳述性文本改為規(guī)范性標(biāo)準(zhǔn)文件。 本標(biāo)準(zhǔn)的附錄A為規(guī)范性附錄。 本標(biāo)準(zhǔn)由農(nóng)業(yè)部畜牧獸醫(yī)局提出。 本標(biāo)準(zhǔn)由全國動物檢疫標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會歸口。 本標(biāo)準(zhǔn)起草單位:農(nóng)業(yè)部動物檢疫所。 本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人:吳延功、杜元釗、朱萬光、劉佩蘭、仰惠芬。 1范圍 本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了動物疫病診斷實驗室的樣品采集方法。 本標(biāo)準(zhǔn)適用于病因(原)學(xué)、病理組織學(xué)、血清學(xué)、免疫學(xué)等實驗室檢驗所需樣品的采集。 2樣品采集的一般原則和采集前的準(zhǔn)備 2.1樣品采集所遵循的一般原則 2.1.1凡發(fā)現(xiàn)患畜(包括馬、牛、羊及豬等)有急性死亡時，如懷疑是炭疽，則不可隨意解剖，應(yīng)采取患畜的血液，萬不得已時局部解剖作脾臟觸片的顯微鏡檢查。只有在確定不是炭疽后，方可進行剖檢。 2.1.2采取病料的種類，根據(jù)不同的疾病或檢驗?zāi)康?，采其相?yīng)的臟器、內(nèi)容物、分泌物、排泄物或其他材料；進行流行病學(xué)調(diào)查、抗體檢測、動物群體健康評估或環(huán)境衛(wèi)生檢測時，樣品的數(shù)量應(yīng)滿足統(tǒng)計學(xué)的要求。采樣時應(yīng)小心謹慎，以免對動物產(chǎn)生不必要的剌激或損害和對采樣者構(gòu)成威脅。在無法估計病因時，可進行全面的采集。檢查病變與采集病料應(yīng)統(tǒng)籌考慮。 2.1.3內(nèi)臟病料的采取，如患畜已死亡，應(yīng)盡快采集，最遲不超過6h。 2.1.4血液樣品在采集前一般禁食8h。 2.1.5應(yīng)做好人身防護，嚴防人畜共患病感染。 2.1.6應(yīng)防止污染環(huán)境，防止疫病傳播，做好環(huán)境消毒和病害肉尸的處理。 2.2使用器械的消毒 刀、剪、鑷子等用具煮沸消毒30min，使用前用酒精擦拭，用時進行火焰消毒。器皿(玻制、陶制等)經(jīng)103kPa高壓30min ，或經(jīng)160℃干烤2h滅菌；或放于0.5%～1%的碳酸氫鈉(NaHCO3)水中煮沸10min～15min，水洗后，再用清潔紗布擦干，保存于酒精、乙醚等溶液中備用。注射器和針頭放于清潔水中煮沸30min。一般要求使用"一次性"針頭和注射器。采取一種病料，使用一套器械與容器，不可用其再采其他病料或容納其他臟器材料。采過病料的用具應(yīng)先消毒后清洗。檢查過傳染性海綿狀腦病的器械要放在2mol/L的氫氧化納(NaOH)溶液中浸泡2h以上，才可再使用。 3樣品的采集 3.1血液 3.1.1采血部位 大的哺乳動物可選用頸靜脈或尾靜脈采血，也可采脛外靜脈和乳房靜脈血。毛皮動物小量采血可穿刺耳尖或耳殼外側(cè)靜脈，多量采血可在隱靜脈采集，也可用尖刀劃破趾墊0.5cm深或剪斷尾尖部采血。嚙齒類動物可從尾尖采血，也可由眼窩內(nèi)的血管叢采血；兔可從耳背靜脈、頸靜脈或心臟采血。禽類通常選擇翅靜脈采血，也可通過心臟采血。 3.1.2采血方法 對動物采血部位的皮膚先剃毛(拔毛)，75%的酒精消毒，待干燥后采血，采血可用針管、針頭、真空管或用三棱針穿刺，將血液滴到開口的試管內(nèi)。禽類等的少量血清樣品的采集，可用塑料管采集。用針頭刺破消毒過的翅靜脈，將血液滴到直徑為3mm～4mm的塑料管內(nèi)，將一端封口。 3.1.3采血種類 3.1.3.1全血樣品 進行血液學(xué)分析，細菌、病毒或原蟲培養(yǎng)，通常用全血樣品，樣品中加抗凝劑。抗凝劑可用0.1%肝素、阿氏液(見第A.l章)(阿氏液為紅細胞保存液，使用時，以1份血液加2份阿氏液)，或枸櫞酸鈉(3.8%～4%的枸櫞酸鈉0.1mL，可抗1mL血液)。采血時應(yīng)直接將血液滴入抗凝劑中，并立即連續(xù)搖動，充分混合。也可將血液放入裝有玻璃珠的滅菌瓶內(nèi)，震蕩脫纖維蛋白。 3.1.3.2血清樣品 進行血清學(xué)試驗通常用血清樣品。用作血清樣品的血液中不加抗凝劑，血液在室溫下靜置2h～4h(防止曝曬)，待血液凝固，有血清析出時，用無菌剝離針剝離血凝塊，然后置4℃冰箱過夜，待大部分血清析出后取出血清，必要時經(jīng)低速離心分離出血清。在不影響檢驗要求原則下可因需要加入適宜的防腐劑。做病毒中和試驗的血清避免使用化學(xué)防腐劑(如硼酸、硫柳汞等)。若需長時間保存，則將血清置20℃以下保存，但要盡量防止或減少反復(fù)凍融。樣品容器上貼詳細標(biāo)簽。3.1.3.3血漿的采集 采血試管內(nèi)先加上抗凝劑(每10mL血加檸檬酸鈉0.04g～0.05g)，血液采完后，將試管顛倒幾次，使血液與抗凝劑充分混合，然后靜止，待細胞下沉后，上層即為血漿。 3.2一般組織 3.2.1采樣方法 用常規(guī)解剖器械剝離死亡動物的皮膚，體腔用消毒的器械剝開，所需病料按無菌操作方法從新鮮尸體中采集。剖開腹腔后，注意不要損壞腸道。 作病原分離用:進行細菌、病毒、原蟲等病原分離所用組織塊的采集，可用一套新消毒的器械切取所需器官的組織塊，每個組織塊應(yīng)單獨放在已消毒的容器內(nèi)，容器壁上注明日期、組織或動物名稱。注意防止組織間相互污染。 3.2.2采樣種類 3.2.2.1病原分離樣品的采集 用于微生物學(xué)檢驗的病料應(yīng)新鮮，盡可能的減少污染。用于細菌分離的樣品的采集，首先以燒紅的刀片燙烙臟器表面，在燒烙部位刺一孔，用滅菌后的鉑耳伸入孔內(nèi)，取少量組織或液體，作涂片鏡檢或劃線接種于適宜的培養(yǎng)基上。 3.2.2.2組織病理學(xué)檢查樣品的采集 采集包括病灶及臨近正常組織的組織塊，立即放入10倍于組織塊的10%福爾馬林溶液中固定。組織塊厚度不超過0.5cm，切成1cm2～2cm2 (檢查狂犬病則需要較大的組織塊)。組織塊切忌擠壓、刮摸和用水洗。如作冷凍切片用，則將組織塊放在0℃～4℃容器中，盡快送實驗室檢驗。 3.3腸內(nèi)容物或糞便 腸道只需選擇病變最明顯的部分，將其中的內(nèi)容物棄去，用滅菌生理鹽水輕輕沖洗；也可燒烙腸壁表面，用吸管扎穿腸壁，從腸腔內(nèi)吸取內(nèi)容物，將腸內(nèi)容物放入盛有滅菌的30%甘油鹽水緩沖保存液(見第A.2章)中送檢?；蛘?，將帶有糞便的腸管兩端結(jié)扎，從兩端剪斷送檢。 從體外采集糞便，應(yīng)力求新鮮。或者，用拭子小心地插到直腸粘膜表面采集糞便，然后將拭子放入盛有滅菌的30%甘油鹽水緩沖保存液中送檢。 3.4胃液及瘤胃內(nèi)容物 3.4.1胃液采集 胃液可用多孔的胃管抽取。將胃管送入胃內(nèi)，其外露端接在吸引器的負壓瓶上，加負壓后，胃液即可自動流出。 3.4.2瘤胃內(nèi)容物采集 反芻動物在反芻時，與食團從食道逆入口腔時，立即開口拉住舌頭，另一只手深入口腔即可取出少量的瘤胃內(nèi)容物。 3.5呼吸道 應(yīng)用滅菌的棉拭子采集鼻腔、咽喉或氣管內(nèi)的分泌物，蘸取分泌物后立即將拭子浸入保存液中，密封低溫保存。常用的保存液有pH7.2～7.4的滅菌肉湯(見第A.3章)或磷酸鹽緩沖鹽水，如準(zhǔn)備將待檢標(biāo)本接種組織培養(yǎng)，則保存于含0.5%乳蛋白水解物的漢克氏(Hanks)液中。一般每支拭子需保存液5mL。 3.6生殖道 可采集陰道或包皮沖洗液，或者采用合適的拭子，有時也可用尿道拭子采集。 3.7眼睛 眼結(jié)膜表面用拭子輕輕擦拭后，放在滅菌的30%甘油鹽水緩沖保存液中送檢。有時，也采取病變組織碎屑，置載玻片上，供顯微鏡檢查。 3.8皮膚 病料直接采自病變部位，如病變皮膚的碎屑、未破裂水泡的水泡液、水泡皮等。 3.9胎兒 將流產(chǎn)后的整個胎兒，用塑料薄膜、油布或數(shù)層不透水的油紙包緊，裝入木箱內(nèi)，立即送往實驗室。 3.10小家畜及家禽 將整個尸體包入不透水塑料薄膜、油紙或油布中，裝入木箱內(nèi)，送往實驗室。 3.11骨 需要完整的骨標(biāo)本時，應(yīng)將附著的肌肉和韌帶等全部除去，表面撒上食鹽，然后包入浸過5%石炭酸溶液的紗布中，裝入不漏水的容器內(nèi)送往實驗室。 3.12腦、脊髓 3.12.1全腦、脊髓的采集 如采取腦、脊髓做病毒檢查，可將腦、脊髓浸入30%甘油鹽水液中或?qū)⒄麄€頭部割下，包入浸過消毒液的紗布中，置于不漏水的容器內(nèi)送往實驗室。 3.12.2腦、脊髓液的采集 3.12.2.1采樣前的準(zhǔn)備 采樣使用特制的專用穿刺針，或用長的封閉針頭(將針頭稍磨鈍，并配以合適的針芯)；采樣前，術(shù)部及用具均按常規(guī)消毒。3.12.2.2采樣方法 3.12.2.2.1頸椎穿刺法:穿刺點為環(huán)樞孔。將動物實施站立或橫臥保定，使其頭部向前下方屈曲，術(shù)部經(jīng)剪毛消毒，穿刺針與皮膚面呈垂直緩慢刺入。將針體刺入蛛網(wǎng)膜下腔，立即拔出針芯，腦脊髓液自動流出或點滴狀流出，盛入消毒容器內(nèi)。 3.12.2.2.2腰椎穿刺法:穿刺部位為腰薦孔。實施站立保定，術(shù)部剪毛消毒后，用專用的穿刺針刺入，當(dāng)刺入蛛網(wǎng)膜下腔時，即有腦脊髓液滴狀滴出或用消毒注射器抽取，盛入消毒容器內(nèi)。 3.12.2.3采樣數(shù)量 大型動物頸部穿刺一次采集量35mL～70mL，腰椎穿刺一次采集量15mL～30mL。 3.13液體病料 采集膽汁、膿、粘液或關(guān)節(jié)液等樣品時，用燙烙法消毒采樣部位，用滅菌吸管、毛細吸管或注射器經(jīng)燙烙部位插入，吸取內(nèi)部液體材料，然后將材料注入滅菌的試管中，塞好棉塞送檢。也可用接種環(huán)經(jīng)消毒的部位插入，提取病料直接接種在培養(yǎng)基上。 供顯微鏡檢查的膿、血液及粘液抹片的制備方法:先將材料置玻片上，再用一滅菌玻棒均勻涂抹或另用一玻片推抹。組織塊、致密結(jié)節(jié)及膿汁等亦可在兩張玻片中間，然后沿水平面向兩端推移。用組織塊作觸片時，持小鑷將組織塊的游離面在玻片上輕輕涂抹即可。 3.14乳汁 乳房先用消毒藥水洗凈(取乳者的手亦應(yīng)事先消毒)，并把乳房附近的毛刷濕，最初所擠的3～4把乳汁棄去，然后再采集10mL左右乳汁于滅菌試管中。進行血清學(xué)檢驗的乳汁不應(yīng)凍結(jié)、加熱或強烈震動。 3.15精液 精液樣品用人工方法采集，所采樣品應(yīng)包括"富精"部分，并避免加入防腐劑。 3.16尿液的采集 在動物排尿時，用潔凈的容器直接接取。也可使用塑料袋，固定在雌畜外陰部或雄畜的陰莖下接取尿液。采取尿液，宜早晨進行。 3.17環(huán)境 為監(jiān)測環(huán)境衛(wèi)生或調(diào)查疾病，可從遺棄物、通風(fēng)管、下水道、孵化廠或屠宰場采集有代表性樣品。 4送檢樣品的記錄 送往實驗室的樣品應(yīng)有一式三份的送檢報告，一份隨樣品送實驗室，一份隨后寄去，另一份備案。樣品記錄至少應(yīng)包括以下內(nèi)容: a)畜主的姓名和畜禽場的地址； b)畜(農(nóng))場里飼養(yǎng)的動物品種及其數(shù)量； c)被感染的動物種類； d)首發(fā)病例和繼發(fā)病例的日期及造成的損失； e)感染動物在畜群中的分布情況； f)死亡動物數(shù)、出現(xiàn)臨床癥狀的動物數(shù)量及其年齡； g)臨床癥狀及其持續(xù)時間，包括口腔、眼睛和腿部的情況，產(chǎn)奶或產(chǎn)蛋的記錄，死亡情況和時間，免疫和用藥情況等； h)飼養(yǎng)類型和標(biāo)準(zhǔn)，包括飼料種類； i)送檢樣品清單和說明，包括病料的種類、保存方法等； j)動物治療史； k)要求做何種試驗； l)送檢者的姓名、地址、郵編和電話； m)送檢日期。 5樣品的運送 所采集的樣品以最快最直接的途徑送往實驗室。如果樣品能在采集后24h內(nèi)送抵實驗室，則可放在4℃左右的容器中運送。只有在24h內(nèi)不能將樣品送往實驗室并不致影響檢驗結(jié)果的情況下，才可把樣品冷凍，并以此狀態(tài)運送。根據(jù)試驗需要決定送往實驗室的樣品是否放在保存液中運送。 要避免樣品泄漏。裝在試管或廣口瓶中的病料密封后裝在冰瓶中運送，防止試管和容器傾倒。如需寄送，則用帶螺口的瓶子裝樣品，并用膠帶或石蠟封口。將裝樣品的并有識別標(biāo)志的瓶子放到更大的具有堅實外殼的容器內(nèi)，并墊上足夠的緩沖材料?？者\時，將其放到飛機的加壓艙內(nèi)。 制成的涂片、觸片、玻片上注名號碼，并另附說明。玻片兩端用細木條分隔開，層層疊加，底層和最上一片，涂面向內(nèi)，用細線包扎，再用紙包好，在保證不被壓碎的條件下運送。 所有樣品都要貼上詳細標(biāo)簽。 附錄A (規(guī)范性附錄) 待檢樣品保存液的配制 A.1阿(Alserer)氏液 葡萄糖 2.05g 檸檬酸鈉(Na3C6H5O7·2H2 O) 0.80g 氯化鈉(NaCl) 0.42g 蒸鎦水(或無離子水) 加至100mL 溶解后，以10%檸檬酸調(diào)至pH為6.1分裝后，70kPa 10 min滅菌，冷卻后4℃保存?zhèn)溆谩?br /> A.2 30%甘油鹽水緩沖液 甘油 30mL 氯化鈉 4.2g 磷酸二氫鉀 1.0g 磷酸氫二鉀 3.lg 0.02%酚紅 1.5mL 蒸餾水 加至100mL 加熱溶化，校正pH值為7.6，100 kPa 15min滅菌，冰箱保存?zhèn)溆谩?br /> A.3肉湯(broth) 牛肉膏 3.5g 蛋白胨 10g 氯化鈉 5g 充分混合后，加熱溶解，校正pH為7.2～7.4，再用流通蒸氣加熱30min，用濾紙過濾，獲苗黃色透 明液體，分裝于試管或燒瓶中，以100kPa20min滅菌。保存于冰箱中備用。 |
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