畜牧人

標題: 請高手分析飼用植酸酶活性的檢測結(jié)果總是很低的原因。 [打印本頁]
作者: fangke3546    時間: 2008-6-7 17:24
標題: 請高手分析飼用植酸酶活性的檢測結(jié)果總是很低的原因。
剛開展飼用植酸酶活性的測定這個項目，檢測結(jié)果總是很低，相差很大，不知道是什么原因，方法如下：
飼用植酸酶活性的測定

一、適用范圍
  

本標準規(guī)定了以分光光度法測定飼用植酸酶活性的方法。適用于作飼料添加劑用的植酸酶產(chǎn)品，也適用于添加有植酸酶的配合飼料、濃縮飼料和添加劑預混合飼料。樣品最低檢出量為90U／kg。
二、方法原理
  

植酸酶在一定溫度和pH條件下，水解低物植酸鈉，生成正磷酸和肌醇衍生物，在酸性溶液中，用釩鉬酸銨處理會生成黃色的[(NH4)3PO4NH4VO3·16MoO3]復合物，在波長415nm下進行比色測定。
三、試劑和溶液

3.1
乙酸緩沖液(I)，c(CH3COONa·3H2O)為0.25mol／L：稱取34.02g三水乙酸鈉于1000 mL燒杯中，加入1000mL蒸餾水溶解，用冰乙酸調(diào)節(jié)pH至5.50±0.01。室溫下存放2個月有效。
3.2
乙酸緩沖液(Ⅱ)，c(CH3COONa·3H2O)為0．25mol／L：稱取34.02g三水乙酸鈉，0.5 g TritonX-100, 0.5g牛血清白蛋白于1000mL燒杯中，加入1000mL蒸餾水溶解，用冰乙酸調(diào)pH至5.50±0.01，室溫下存放2個月有效。
3.3
植酸鈉溶液，c(C6H6O24P6Na12)為7.5mmol／L：稱取0.6929g肌醇六磷酸鈉(C6H6O24P6Na12)于100mL容量瓶中，用乙酸緩沖液(3.1)溶解并定容至刻度，現(xiàn)用現(xiàn)配(實際反應液中的最終濃度為5.0 mmol／L)。
3.4
硝酸溶液：1+2水溶液。
3.5
100g／L鉬酸銨溶液：稱取10g鉬酸銨[(NH4)6Mo7O24·4H2O]于100mL。容量瓶中，加入1．0mL氨水(25％)用水溶解定容至刻度。
3.6
2.35 g／L釩酸銨溶液：稱取0.235 g釩酸銨(NH4VO3)于100mL棕色容量瓶中，加入2 mL硝酸溶液(3.4)，用水溶解定容至刻度。避光條件下保存一周有效。
3.7
顏色終止液：移取2份硝酸溶液(3.4)，1份鉬酸銨溶液(3.5)，1份釩酸銨溶液(3.6)混合后使用，現(xiàn)用現(xiàn)配。
3.8 磷酸二氫鉀(KH2PO4)：基準物。
3.9
清洗試驗用容器不要用含磷清洗劑。
四、儀器和設備
4.1
實驗室常用儀器設備.
4.2
恒溫水浴：(37±0.1)℃。
4.3
分光光度計：有10mm比色皿，可在415nm下測定吸光度。
4.4
磁力攪拌器。
4.5
渦流式混合器。
4.6
酸度計：精確至小數(shù)點后2位。
4.7
離心機：轉(zhuǎn)速為4000r／min以上。
4.8
秒表
五、試樣制備
   
取有代表性樣品，用四分法將試樣縮分至200g，植酸酶產(chǎn)品不需粉碎，配合飼料和添加劑預混合飼料需粉碎通過0.45mm標準篩，裝入密封容器，防止試樣成分變化。
六、測定步驟
6.1 標準曲線
   
準確稱取0．6804g在105℃烘至恒重的基準磷酸二氫鉀(5．9)于100mL容量瓶中，用乙酸緩沖液(3．1)溶解，并定容至100mL濃度為50.0mmol／L。準確移取磷標準溶液（50mmol/L）0，1.0，2.0，3.0，4.0， 5.0ml于50ml容量瓶中，與試樣一起反應測定，以無機磷濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標，列出直線回歸方程(y＝ax+b)。
6.2 試樣溶液的制備
   
稱取0.5g—0.7g兩個試樣(表示酶活為6000U)精確至0.0001 g，同時稱取0.5g—0.7g參考樣(已知活性的植酸酶),分別置于100mL容量瓶中，加入約70mL乙酸緩沖液(3.2)，一個磁力棒，在磁力攪拌器上高速攪拌30min，用乙酸緩沖液(3.2)定容至刻度(減去磁力棒的體積)。搖勻，在離心機上以4000r／min離心10min。
分取1ml上清液,用乙酸緩沖液(3.2)定溶至100ml，搖勻,再吸取稀釋后的溶液10ml用乙酸緩沖液(3.1)定溶至100ml.使樣液濃度保持在0.08U／mL左右，待反應。
6.3 反應
   
取10mL試管按下面的反應順序進行操作，在反應過程中，從加入底物(3.3)開始，向每支試管中加入試劑的時間間隔要絕對一致，37℃水解30min。反應步驟及試劑、溶液用量見表2。
6.4
樣品測定
反應后的試樣在室溫下靜置10min，如出現(xiàn)混濁需在離心機上以4000r／min離心10min，
上清液以標準曲線的空白調(diào)零，在分光光度計415 nm波長處測定樣品空白(A0)和樣品溶液(A)的吸光值，A-A0。為實測吸光值。用直線回歸方程計算植酸酶的活性。
   

表2
反應順序
樣品、標準
樣品空白(標準空白)
1．加入待反應液
2.0 mL
2 mL
2．37℃預熱5 min
√
－
3．依次加入底物(3.3)
4 mL
4 mL(第二步)
4．混合
√
√
5．37℃水解30min
√
－
6．依次加入終止液(3.7)
4 mL
4mL(第一步)
7．混合
√
√
總體積
10 mL
10 mL

七、結(jié)果計算
  
式中：
U——試樣中植酸酶的活性，U／g；
   
C——根據(jù)實際樣液的吸光值由直線回歸萬程計算出的酶活性，U；
   

F——試樣溶液反應前的總稀釋倍數(shù),50000；
   
M——試樣質(zhì)量，g；
   

30——反應時間，min。
7.2
結(jié)果表示
   
兩個平行樣品的測定結(jié)果用算術平均值表示，保留整數(shù)。
7.3重復性
   
同一樣品兩個平行測定值的相對偏差，植酸酶產(chǎn)品不大于8％，添加植酸酶的各種飼料樣品不大于10％。
作者: 薛侃    時間: 2008-6-11 17:51
你這個問題好像很難哦，可能就只有植酸酶生產(chǎn)廠家才測這個指標。所以能跟你討論的人應該很少。但我期待高手的出現(xiàn)！
作者: zhengronghai    時間: 2008-6-11 20:24
使用哪家的植酸酶啊？
作者: fangke3546    時間: 2008-6-18 21:26
倒是大廠家的
按理說不應該這樣的，TritonX-100對檢測結(jié)果的影響到底有多大啊
作者: tgz5637    時間: 2008-6-19 09:25
哈哈，剛好我就是高手，很多賣酶的恐怕連酶檢測的基本概念都沒弄清。今天毛遂自薦、魯班面前耍大刀，關公面前弄弄斧。
1 牛血清白蛋白是穩(wěn)定劑，TritonX-100是表面活性劑，在分子生物學實驗里用得很多。兩個一塊用，無非是減少酶樣被浸提萃取及稀釋過程中酶的失活，減少酶在試管壁殘留，缺點是用量大后，產(chǎn)生的泡沫很多，不容易定容，可以稍微加幾滴無水酒精消泡，（乙醇在酶工業(yè)也用于提取，但濃度和時間有限制，濃度上限是20～30%（V/V)）,實際上，對于沒有加入飼料里的純酶檢測，如果馬上測定，不加影響不大，（但記住做標準曲線時，也不能用乙酸緩沖液2，保證同樣條件才可以），如果用加了穩(wěn)定劑的緩沖液，比用不加的測定結(jié)果高一些。加入飼料的檢測，由于要萃取，故此要加，而且，穩(wěn)定劑的添加量要加大。
2  檢測偏低情況，多數(shù)是底物配制出問題，稱重很少出問題（除非你的儀器很久沒有校正了），必須先調(diào) pH，再來用緩沖液定容。（緩沖液在其緩沖范圍，如乙酸鹽的緩沖范圍是pH3.6～5.8，都有一定緩沖能力，調(diào)好pH再定容后的pH是不會改變的）。先定容后調(diào)pH,導致底物濃度不足，結(jié)果偏低。只用緩沖液溶解植酸鈉，不調(diào)pH,直接定容，測定結(jié)果也是偏低，因為pH偏離5.5。
3
怎樣來理解酶活的定義呢？對采用分光光度法，采用的原理是對等比色，即同樣的確定條件下，
一個酶活單位分解植酸產(chǎn)生的產(chǎn)物的吸光度值等同于一微摩爾無機磷與顯色劑產(chǎn)生的吸光度值。在得到的標準曲線上找出測定吸光值對應的無機磷的量，返推出酶活大小。要注意回歸方程的得到的代表無機磷量的單位是什么？你才能理解計算公式的含義。

另一種情況的可能性是你做標準曲線和計算公式根本就不正確，導致計算公式錯誤，結(jié)果偏低。
如果磷酸二氫鉀的濃度對OD值做標準曲線，濃度單位是微摩爾/mL, 回歸方程單位也換算成微摩爾/mL，計算公式=（回歸方程×稀釋倍）/(稱樣量×30)；如果是以磷酸二氫鉀的物質(zhì)的量對OD值做標準曲線，物質(zhì)量單位是微摩爾，計算梯度時，要乘以0.2。計算公式=（回歸方程×稀釋倍）/(0.2×稱樣量×30)；

怎樣做標準曲線，可以找書自己看看。

4 例子：5000單位的植酸酶，稱樣0.8g,稀釋10000倍，OD=0.320, 回歸方程以磷酸二氫鉀的物質(zhì)的量對OD值做標準曲線，為y=7.840x+0.002,代入第二公式計算，酶活=7.840×0.320×10000/(0.2×0.8×30)=5220u/g

5 其他可能出問題的地方，多數(shù)是些低級錯誤！
       可能就是顯色劑配制沒配好，多數(shù)出在礬酸銨沒溶解好，量不夠，顯色偏低。如果偷懶，沒有每次重配顯色劑后，重測標準曲線，就套用原來的回歸公式，就犯錯?；蛘卟椴橄跛嵋号鋵]有。
      又或者植酸酶的萃取浸提時間不足，以上清液來測，酶活自然偏低。
      或者你的恒溫槽恒溫溫度有誤?；蛘叻止夤舛扔嬘袉栴}。不是單色光，向濃度軸發(fā)生偏離。自然測定值低。
       不是自己測定回歸方程，而是使用別人提供的或在其他機器上測定的回歸方程，計算自然謬誤差之千里。

[ 本帖最后由 tgz5637 于 2008-6-20 10:52 編輯 ]
作者: fangke3546    時間: 2008-6-26 14:49
不勝感激,請問我應該怎么樣來檢驗上述環(huán)節(jié)是否存在問題,怎樣解決這些問題呢
另外,我還想請問在計算的時候國家標準上提到"C——根據(jù)實際樣液的吸光值由直線回歸萬程計算出的酶活性，U",那C是怎么計算的啊?
我能貿(mào)然問一句,我能否電話與你聯(lián)系?
作者: 微塵    時間: 2008-6-26 17:33
華南農(nóng)大近期有個有關酶制劑的檢測培訓，是個不錯的學習機會
作者: fangke3546    時間: 2008-6-27 12:38
什么時間,有具體信息嗎
作者: fangke3546    時間: 2008-6-27 14:53
tgz5637的分析非常透徹,我剛剛接觸植酸酶不久,不清楚各個因素的影響到底有多大,tgz5637能否更詳細的分析評估一下各個因素的影響.
我的磷標準曲線的回歸方程的系數(shù)沒你的大,我的只有二點幾,不知到怎么回事,我懷疑標準曲線的制作也存在一些問題.
我的郵箱是aipu_tchx@yahoo.com.cn,方便的話可否告知電話號碼.
作者: fasetuan    時間: 2008-6-27 15:18
確實是個很深奧的問題,沒有測過這個項目,學習中......
作者: tgz5637    時間: 2008-7-5 17:17
酶制劑檢測，導致誤差最大的因素就是底物和稀釋倍數(shù)。制定植酸酶行業(yè)標準的時候，對測定顯色的吸光值線性范圍規(guī)定得很大，這對測定未知樣時，會造成很大困惑。可以看看這篇
http://www.jmyingheng.com/   >技術交流>生物技術>《酶制劑檢測的非定義性因素的影響》一文。
  c 指的是回歸方程，這里一般是指一元方程y=ax+b。怎么由標準曲線求回歸方程恐怕你要查看書了。檢測方法以濃度對吸光值做圖，得到的c的單位就是umol/ml，以物質(zhì)的量對吸光值做圖，得到的c的單位就是umol。

如果懷疑試劑有問題，就全部重配重買。
這些只能自己檢查-----pH增加pH精密試紙對照校正緩沖液、底物溶液。pH電計用標準液，看看配對了沒有？顯色劑配對了沒有？分光光度計有無偏差？植酸鈉底物是否有效？同時注意底物必須現(xiàn)配現(xiàn)用，不能使用超過12小時的底物溶液。
其他的可以把做標準曲線的測定值發(fā)來本站郵箱，就可知道回歸方程是多少。
    最好找已知酶活的樣品，做平行測定，可以知道是試劑問題，還是酶本身失活了。

[ 本帖最后由 tgz5637 于 2008-7-5 17:46 編輯 ]
作者: tgz5637    時間: 2008-7-7 09:19
標題: 回復 9樓 fangke3546 的帖子
回歸方程數(shù)值偏低，表明做標準曲線時，同一梯度標準樣液的測定吸光度值偏大；
查查什么原因?qū)е挛庵灯螅匡@色劑配制錯誤，分光度計平時是否常用，測其他產(chǎn)品有無問題？標準曲線至少5個數(shù)據(jù)點的相關性，要求達到 r=0.999。
作者: qinqin0226    時間: 2008-7-7 22:59
很好的學習機會啊,我本來也要做這個實驗的,剛申請了藥品的,現(xiàn)在不用做了，由別人去做了,很有些遺憾哦.
作者: JH_C    時間: 2008-7-16 11:37
標題: 木聚糖酶檢測
底物1%燕麥木聚糖經(jīng)冰凍保存后取出，會產(chǎn)生沉淀，請問還能繼續(xù)使用嗎？
作者: fangke3546    時間: 2008-7-18 20:57
tgz5637能講講標準曲線的問題嗎
我做出來的系數(shù)這么與你的相差那么大啊，我的在18左右
另外我想問一下，牛血清白蛋白組分幾對檢測好一些？
謝謝
作者: tgz5637    時間: 2008-7-19 15:56
直接把標準曲線數(shù)據(jù)貼上來看看

關于標準曲線請看這個網(wǎng)址。http://www.esnips.com/nsdoc/5426 ... f0a/?action=forceDL
作者: xiaoyanzhu2002    時間: 2008-7-29 10:14
標題: 回復 5樓 tgz5637 的帖子
您的確是高手。受教了，非常感謝！
作者: bingerhan    時間: 2008-10-21 23:58
我想請問一下測植酸酶時標準曲線怎么繪制？怎樣來確定它的濃度范圍？酶樣的稀釋倍數(shù)又該如何確定？為什么最后都要使樣液保持在某一個濃度左右？謝謝！
作者: xiedahai    時間: 2008-10-22 00:15
領教了！請問有沒有市場上幾大植酸酶公司產(chǎn)品的植酸酶活性的檢測數(shù)據(jù)（不是廠家提供的數(shù)據(jù)）？在此先謝謝了！
作者: 默者    時間: 2008-10-22 07:43
酶制劑活性測定通常有“測不準”原理，剛開始做的時候酶活總是不穩(wěn)定，不過時間長了以后便會趨于穩(wěn)定
作者: wy0351    時間: 2011-1-26 16:33
回復 tgz5637 的帖子

您好，請恕我冒昧，我想請教您一個問題，植酸酶檢測計算公式中y是回歸方程中的x嗎，y是根據(jù)實際樣液吸光值由直線回歸方程計算出的無機磷的量，而回歸方程中橫坐標是無機磷的量。
作者: yingang11125_74    時間: 2011-1-28 09:45
沒測過:handshake



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