畜牧人

標題: β-葡聚糖酶活力測定 [打印本頁]

作者: 和興 時間: 2008-8-6 16:53
標題: β-葡聚糖酶活力測定
1．原理
在一定溫度和PH條件下β-葡聚糖酶水解β-葡聚糖。產(chǎn)生的還原糖可將3，5-二硝基水楊酸中的硝基還原成橙色的氨基化合物，反應(yīng)液顏色強度與酶解產(chǎn)生的還原糖的量成正比，而還原糖生成量又與待測液的酶活力大小成正比。通過測定反應(yīng)液的吸光度，從而計算出待測液β-葡聚糖酶活力。
2．試劑和溶液：
2．110.0mg/ml的葡萄糖溶液
稱取無水葡萄糖1.0000g加水溶解后定容至100ml。
2．20.05mol/L檸檬酸鹽酸性緩沖液
a、0.5mol/L的檸檬酸溶液：
準確稱取105.0g檸檬酸完全溶于800ml的蒸餾水中，定容至1000ml。標記為A試液.
b、0.5mol/L的檸檬酸三鈉溶液：
準確稱取147.0g檸檬酸三鈉完全溶于800ml的蒸餾水中，定容至1000ml。標記為B試液.
c、0.5mol/L的檸檬酸鈉緩沖液：
取600ml的A試液與1000ml的B試液充分混勻。標記為C試液.
d、0.05mol/L的檸檬酸鹽酸性緩沖液（pH 4.80）：
取C試液1000ml加入到8000ml的蒸餾水中。用PH計檢測其PH值，必要時用3mol/L的鹽酸溶液或3mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)PH值為4.80。再定容至10000ml?；靹蚝髽擞洖?.05mol/L酸性緩沖液,同時標記pH=4.80、配制日期。在4℃冰箱內(nèi)保存。
2．31.0%β-葡聚糖底物：
精密稱取β-葡聚糖1.0000g溶于100mL 0.05mol/L的酸性緩沖液中，磁力攪拌至完全溶解（室溫下3小時以上）。用3mol/L鹽酸溶液或3mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)pH值為4.80，再用0.05mol/L的酸性緩沖液定容在100 mL的容量瓶中。標記為1.0%β-葡聚糖酸性溶液，同時標記pH=4.80、配制日期。保存在4℃的冰箱內(nèi)。使用前恢復(fù)到室溫，并搖勻。
2．4DNS試劑
溶解10.0g3,5—二硝基水揚酸，16.0g氫氧化鈉和300.00g酒石酸鉀鈉于約700 mL蒸餾水中，加熱攪拌使完全溶解至澄清，放至常溫并用蒸餾水定容至1000 mL,置棕色試劑瓶中，暗處保存一個星期后使用。
3．儀器和設(shè)備：
3．1 分析天平：感量0.0001g
3．2 精密pH計：精確至0.01
3．3 磁力加熱攪拌器
3．4分光光度計：應(yīng)符合GB9721有關(guān)規(guī)定，5mm比色皿
3．5電熱恒溫水浴鍋：30—100℃，±0.1℃
3．6 計時器：每小時誤差不超過五秒
3．7 移液器：100—1000μl
3．8 微量進樣器：0-50μl
4．分析步驟：
4．1 標準曲線的繪制：
取8支試管按下表加入試劑，稀釋葡萄糖標準液；再加入3 mL DNS試劑。充分混勻置沸水中煮5min。水浴冷卻后，用0號試管作對照在540nm下測其他試液的吸光度。以吸光度為縱坐標，以葡萄糖含量為橫坐標繪制標準曲線。

試管號	0	1	2	3	4	5	6	7
緩沖液加入量（μL ）	1000	990	980	975	970	965	960	955
葡萄糖標準液加入量（μL）	0	10	20	25	30	35	40	45
葡萄糖含量（μg）	0	100	200	250	300	350	400	450

4．2 待測酶液的制備：
4．2．1液體酶：用緩沖液稀釋原酶液，使其吸光度（OD值）在0.20— 0.25之間。
4．2．2 固體酶：精密稱取固體原酶粉1.0000g溶于80ml蒸餾水中（稀釋倍數(shù)≤100倍的直接用緩沖液溶解）；室溫下磁力攪拌15min以上；用100ml容量瓶定容。離心后取清液用緩沖液稀釋，使其吸光度在0.20— 0.25之間。
4．3 水平控制：
用已知酶活力的標準樣作水平檢查。
4．4 活力的測定：
4．4．1 取三支試管各加入0.5ml底物，與待測酶液一起在50℃（±1℃）水浴中預(yù)熱5min。
4．4．2 在第一、二試管中各加入0.5ml待測酶液，40℃水浴中反應(yīng)10min。
4．4．3 在三支試管中各加入3ml的DNS試劑，然后在第三支試管中加入0.5ml的待測酶液
4．4．4 搖勻三支試管后，在沸水浴中煮5min。
4．4．5 水浴冷卻至室溫后，以第三支試管為對照在540nm條件下測第一、二試管樣的吸光值。吸光值以在0.20— 0.25之間為宜，若不在此范圍可改變稀釋倍數(shù)重做。
5．酶活力的計算：
酶活力（IU/mL或IU/g）= (葡萄糖等量值/180/10/0.5）×n
式中：180指葡萄糖從微克換算成微克分子數(shù)
10指待測液與底物的反應(yīng)時間
0.5指與底物反應(yīng)的待測酶液量
n指原酶液（或固體原酶）的稀釋倍數(shù)
6．允許分析結(jié)果可以接受標準：
6．1 允許總分析誤差范圍，兩次取樣并且檢測結(jié)果相對誤差小于10%。
6．2 水平控制檢測酶活力與標準活力相對誤差小于10%。
6．3 標準曲線至少由5點組成

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