畜牧人

標題: 檢測口蹄疫病毒抗原的方法 [打印本頁]
作者: 曹志誠    時間: 2008-9-24 21:30
標題: 檢測口蹄疫病毒抗原的方法
檢測口蹄疫病毒抗原的方法

（一）口蹄疫反向被動紅細胞凝集試驗（反向被動血凝）

紅細胞膜具有吸附抗原或抗體的特性，將提純的口蹄疫抗體（IgG）在pH4.0醋酸緩沖液中致敏綿羊紅細胞，當這種被致敏的紅細胞（即紅細胞表面均帶有口蹄疫抗體），遇到相應的口蹄疫病毒抗原時，便產生抗原抗體的特異性反應，從而使紅細胞發(fā)生肉眼可見的凝集現(xiàn)象。該法快速、簡便、準確、可同步鑒定出口蹄疫毒型和鑒別口蹄疫、豬水泡病病原。
    1．試驗材料
V型96孔130o血凝滴定板、玻璃吸管（1毫升、5毫升規(guī)格）、玻璃中試管（內徑15毫米，長度100毫米）、試管架、微量振蕩器、微量移液器、塑料咀、玻璃板（與血凝板大小一致）、口蹄疫O、A、C、Asia-I 型、SVD（豬水泡?。┓聪虮粍友\斷試劑及其配套用的口蹄疫各型、豬水泡病陽性抗原、陰性抗原、稀釋液、待檢抗原。
２．試驗方法
　（１）稀釋待檢抗原  取中試管8支，橫列于試管架上，每管各加入稀釋液1 毫升，取待檢抗原1毫升加入第1管混勻后從中取出1毫升加入第2管，混勻后取1毫升加入第3管……直至第8管，此時待檢抗原的稀釋度依次為1：6、1：12、1：24、1：48、1：96、1：192、1：384、1：768。
?。ǎ玻┫♂岅幮钥乖?/strong>取中試管1支用記號筆標明“陰抗”字樣，加入稀釋液390微升，加入陰性抗原10微升，充分混勻，此時陰性抗原的稀釋度為1：40。
?。ǎ常┫♂岅栃钥乖?/strong>  取中試管20支，橫列于管架標明“陽抗”字樣，每排4支，（O型4支、A型4支、C型4支、Asia-1型4支、SVD4支）。每種陽抗第1管，加稀釋液4.7毫升，第2~4管各加稀釋液0.5毫升。取O型陽性抗原0.1毫升(100微升)加入第1排的第1管中混勻后取出0.5毫升，加入第1排的第2管并充分混勻，取出0.5毫升加入第1排的第3管混勻后取出0.5毫升加入第1排的第4管并混勻。
    其他陽性抗原均按上法稀釋，注意每稀釋一種陽抗必須更換1支吸管，切勿混雜以免影響反應的特異性。經過上述稀釋，各陽性抗原的稀釋度依次為1：48、1：96、1：192和1：384。用于陽抗對照孔的只加第4管（1：384）的陽抗。
?。ǎ矗┑渭哟龣z抗原和對照抗原　取第8管稀釋的待檢抗原（1：768）加入血凝滴定板上的1~5排的第8孔，每孔50微升，取第7管待檢抗原（1：384）加入1~5排的第7孔，取第6管待檢抗原（1：192）加入1~5排的第6孔……直至第1孔，每孔均為50微升。1~5排的第10孔加入1：40的陰性抗原，每孔50微升。1-5排的第11孔依次加入O、A、C、 Asia-1型和SVD1：384稀釋度的陽性抗原，每孔50微升（即第1排的第11孔加O型抗原；第2排的11孔加A型抗原；第3排的11孔加C型抗原；第4排的11孔加Asia –1型抗原；第5排的11孔加SVD抗原）。1-5排的第12孔各加稀釋液50微升作為稀釋 液對照。
?。ǎ担┑渭臃聪虮粍友\斷液  血凝板上的第1排1~8孔和10~12孔加O型診斷液，每孔25微升。第2排1~8孔和10~12孔加入A型診斷液，每孔25微升。第3排1~8孔和10~12孔加入C型診斷液，每孔25微升。第4排1~8孔和10~12孔加入Asia-1型診斷液，每孔25微升。第5排1~8孔和10~12孔加入SVD診斷液，每孔25微升。
　（６）振蕩血凝板　加畢診斷液后，立即將血凝板置于微量振蕩器上，中速振蕩30秒，取下血凝板放在白紙上觀察各孔的紅細胞是否均勻懸浮，孔底應無紅細胞沉淀，若全部或部分孔底尚有紅細胞沉積，應繼續(xù)在振蕩器上振蕩，直至充分混勻為止。
?。ǎ罚┦覝叵蚂o置  將混勻的血凝板，蓋上玻璃板后靜置2小時，判定檢測結果，若對照孔紅細胞沉降不清晰或因故來不及判定，也可靜置第2天判定。
３． 判定標準
先觀察血凝板上1~5排的10~12孔，每排的第10孔為陰性抗原對照孔，應無凝集現(xiàn)象，紅細胞應全部沉入孔底，形成邊緣整齊的小圓點；每排的11孔為陽性抗原對照孔，應出現(xiàn)“++” ~“#”的凝集現(xiàn)象（即有50~100%紅細胞發(fā)生凝集，紅細胞懸于孔中，不沉入孔底），證明所加的反向診斷液效價不低于1：384，用于檢測抗原合格；每排的第12孔為稀釋液對照孔，也應無凝集現(xiàn)象，紅細胞應全部沉入孔底，形成小圓點。
在上述對照孔判定合格的前提下，仔細觀察血凝板上的1~5排的1~8孔，某排1~8孔或1~6孔均有“++” ~“#”凝集現(xiàn)象，而其余4排僅在1~2孔出現(xiàn)“+” ~ “++”的凝集，即可判定該份待檢抗原為陽性。其型別與所加的反向診斷液的型別相同。比如第1排1~8孔出現(xiàn)“++”以上的紅細胞凝集，第2~5排無此現(xiàn)象，便可判定該待檢抗原為O型口蹄疫。
以出現(xiàn)“++”以上凝集的待檢抗原最大稀釋度為其抗原滴度。例如第1排的1~4孔出現(xiàn)“#”凝集，第5孔出現(xiàn)“+++”凝集第6孔出現(xiàn)“++”凝集，第7孔出現(xiàn)“+”凝集，第8孔無凝集現(xiàn)象，即判定該待檢抗原為O型，滴度為1：192（以第6孔出現(xiàn)“++”凝集為滴度的終點）。
４．注意事項
　（１）勿用90o和110 o血凝板，防止誤判。

（２）陰性抗原、陽性抗原和稀釋液3孔對照全部或部分出現(xiàn)不合格時，檢測結果不能判定，應更換試劑重新檢測，以免錯判。
?。?/font>３）嚴重腐敗變質的病料不宜檢測，以防非特異反應。
?。ǎ矗┎×咸?，無法檢測時，可制成1：10或1：20懸液，先接種3~5日齡小白鼠，連傳3代后，用鼠組織制成待檢抗原，再進行檢測。
?。ǎ担z測過程中，有時出現(xiàn)前帶現(xiàn)象，即第1孔或第2孔的紅細胞沉淀形成小園點，第3孔以后又出現(xiàn)“++”以上的凝集，這是因為抗原抗體比例失調所致，不影響結果判定。
    反向被動紅細胞凝集試驗的診斷液及其配套試劑由中國農科院蘭州獸醫(yī)研究所供應。
（二）口蹄疫微量補體結合試驗
    補體的作用是無特異性的，它能與任何一組抗原抗體復合物結合并不再游離。但不能單獨與抗原或抗體結合。當抗原與其相應的抗體結合成復合物之后，可與補體結合，但這種反應不能用肉眼觀察。如果抗原是紅細胞與其相應抗體（溶血素）形成復合物后，當有補體存在時，紅細胞就發(fā)生溶血；如補體已被其他抗原抗體復合物結合，則不溶血。這種現(xiàn)象用肉眼是可以觀察到的。因此利用溶血反應作為指示劑，以檢驗補體是否已被前一種抗原抗體系統(tǒng)所結合，這種試驗叫做補體結合試驗。前者稱為溶菌系統(tǒng)或試驗系統(tǒng)，后者稱為溶血系統(tǒng)。如果溶菌系統(tǒng)的抗原抗體是相應的，則補體被結合，加入溶血系統(tǒng)后不發(fā)生溶血。反之，二者不對應，則補體游離，加入溶血系統(tǒng)后發(fā)生溶血。所以在補體結合試驗中，溶血判為陰性；不溶血則判為陽性。
操作步驟如下：
１．測定溶血素效價
    （1）取試管10支列于管架上，1~10管內各加生理鹽水0.5毫升
    （2）取溶血素0.2毫升加生理鹽水9.8毫升=1:100 的溶血素。
    （3）取1：100的溶血素1毫升加生理鹽水4毫升=1：500溶血素。
    （4）取1：500的溶血素0.5毫升 加入第1管混勻并取出0.5毫升加入第2管混勻，并取出0.5毫升加入第3管……以此類推，直至第8管。并取出0.5毫升棄去，1~8管的溶血素稀釋度依次為1：1 000~1：8 000，第9、10管為對照管。
    （5）將補體（豚鼠血清）用生理鹽水稀釋成1：10，1~9管各加0.5毫升，第10管不加補體而加1：500的溶血素0.5毫升。
    （6）將洗凈的紅細胞沉淀用生理鹽水配成2%濃度，1~10管各加0.5毫升。
    （7）每管充分混勻置37℃水浴中作用20分鐘后判定效價。
（8）以出現(xiàn)完全溶血的溶血素最大稀釋度為其效價。


溶血素效價滴定表（劑量毫升）

試管號             1    2
3
  4
  5    6
  7  
8    9
10
生理鹽水          0.5  0.5  0.5  0.5  0.5  0.5  0.5
0.5
0.5  0.5
1：500溶血素     0.5
補體（1：10）     0.5  0.5  0.5  0.5  0.5  0.5  0.5  0.5  0.5  0.5(1:500溶血素)
紅細胞（2%）      0.5  0.5  0.5  0.5  0.5  0.5  0.5  0.5  0.5  0.5

                           37℃20分鐘
判定效價
—   —   —   —   +   ++   +++   ＃   ＃   ＃
按此表滴度結果，該溶血素效價＝1：4 000，工作濃度為效價的4倍即1：1 000。
1． 測定補體效價
溶血素效價被測出后，即可滴定補體效價。新鮮補體或凍干補體被稀釋后，容易失效，宜用10% NaCl保存，即補體1份十10%Nacl 1份，混合后置4℃或-20℃貯存有效期2~3個月。
取保存補體2毫升加生理鹽水8毫升=1：10的補體。
按下表程序及劑量進行滴定。
補體效價滴定表    （劑量:毫升）

試管號              1      2       3       4   
5     
6      7      
8
生理鹽水         
0.05    0.1     0.15    0.2    0.25    0.3   0.35   0.4
補體（1：10）     0.45    0.4     0.35    0.3    0.25    0.2   0.15   0.1
溶血素（工        0.5     0.5     0.5     0.5    0.5     0.5   0.5    0.5
作濃度）
紅細胞（2%）     0.5     0.5     0.5     0.5    0.5      0.5   0.5    0.5
                                 37℃30分鐘
判 定
—      —     —       +      ++      +++    ＃     ＃
以出現(xiàn)完全溶血的補體最大稀釋度為其效價。

按此表測出的該補體效價為0.35，工作濃度為0.45。
以上A和B兩步驟稱為預備試驗，溶血素一般半年滴定一次。而補體則必須在每次試驗前滴定，如果補體效價不準確，將會影響試驗的結果。
    3．將標準血清（已知陽性血清）用生理鹽水稀釋成1：4（陰性血清1毫升加生理鹽水3毫升）。標準血清的補反效價必須達到1：80以上）。
    4．在96孔或24孔U型微量滴定板上，1~5排的1~7孔，各滴2滴（約50微升）生理鹽水，半小時后棄去，以防板孔對反應成分的非特異吸附。
① 將待檢抗原稀釋成1：3、1：6、1：12和1：24，分別滴入1~5排的1~4孔，每孔1滴（約25微升）。
② 第1-5排的第5孔滴入陰性抗原各1滴；1~5排的第6孔依次分別滴入O、A、C、Asia-I 型和SVD陽性抗原1滴，1~5排的第7孔各滴入鹽水1滴,作為陰性、陽性和鹽水對照。
③ 1~5排的1~4孔依次分別加入O、A、C、Asia-I 型和SVD標準清1滴（25微升）。
④ 1~5排的1~7孔各加補體工作濃度2滴（50微升）。
⑤ 微量振蕩器上振蕩1分鐘，37℃溫箱保溫40分鐘。
⑥ 每孔各加溶血素工作濃度1滴。
⑦ 每孔各加2%紅細胞1滴。
⑧ 振蕩器上振蕩一分鐘，37℃溫箱30分鐘后判定結果。
5．判定標準：先檢查對照孔，第5和第7孔應完全溶血為合格；第1~5排的第1~4孔中任一孔呈現(xiàn)不溶血則判該份待檢抗原為陽性，其型別與所加標準血清的型別相同。
該法操作較繁瑣，敏感性低，但特異強。
（三）口蹄疫酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）
八十年代以來，國外常采用ELISA鑒定口蹄疫和豬水泡病病毒。國內也有人試用該法對FMDV 和SDV進行檢測，由于IgG的純度不高，經常出現(xiàn)非特異性反應。影響檢測的準確性，使推廣應用受到限制。
ELISA技術雖然多種多樣，但一般以雙抗體夾心法居多。用最適濃度抗口蹄疫血清的IgG包被酶標板孔4℃過夜，經洗滌后加入待檢抗原37℃保溫1小時，洗滌后再加辣根過氧化物酶標記的兔抗豚鼠血清的IgG 37℃保溫1小時，洗滌后加底物溶液（鄰苯二胺和H2O2），30分鐘后用2M H2SO4中止反應，751型分光光度計492nm測定光密值或在酶標檢測儀上直接測定。陽性OD值為0.7~0.9；陰性OD值為0.1~0.3。
（四）免疫熒光直接檢檢測口蹄疫帶毒肉品的操作方法
    1．試驗材料
   （1）熒光顯微鏡及自動照相裝置       1臺
   （2）冰凍組織切片機                 1臺
   （3）電熱恒溫箱            
       1臺
   （4）玻璃染色缸                     2具
   （5）玻璃片                         5盒
   （6）組織切片盒                     2個

（7）抗體（O型、A型、Asia-I型、SVD等4種）

（8）0.01MpH7.2~7.4的PBS
   （9） 丙酮
   （10） 伊文斯蘭（萬分之二濃度）
    2．操作方法
    （1）剝離淋巴結周圍的脂肪及被膜，將淋巴結剪成長1.5~2cm ,寬0.8~1cm 厚 0.3~0.5cm的組織塊。

（2）在冷凍組織切片機上，低溫切成5~6微米的薄片，每份淋巴結切片8張，迅速粘貼在潔凈的載玻片上，并用記號筆編號。

（3）
冷丙酮固定（室溫下20分鐘或在4℃下30分鐘）。
    （4）0.01MpH7.2~7.4 PBS漂洗3次，每次1分鐘，用濾紙吸去樣品周圍水份，切勿碰損樣品，再用吹風機吹干樣品。
    （5）滴加熒光抗體工作液，以復蓋樣品為度，置溫盒37℃溫箱保溫30分鐘。
    （6）PBS洗3次，濾紙吸水并吹干。
    （7）熒光顯微鏡下觀察。


3．判定標準

（1） 先判定已知陰性淋巴結切片染色結果，僅見組織細胞的輪廓，應無翠綠色光點出現(xiàn)，或見少數(shù)（視野內少于5個）橙黃色小點，視為合格。
    （2）細胞質內出現(xiàn)成堆的有時呈放射狀翠綠色亮點，判為“#”；胞質內出現(xiàn)5個以上翠綠色熒光點為“+++”胞質內出現(xiàn)2~3個綠色熒光點為“++”；視野中僅見1~2個綠色熒光點為“+”，未見任何熒光點則為“—”。
    （3）出現(xiàn)“++”以上（含“++”）的熒光判為陽性，“+”判為可疑，“—”為陰性。
     4． 注意事項

（1）根據(jù)本地及鄰近地區(qū)的疫情，認為有必要時，每份樣品應切片8張，每種熒光抗體染色2張切片進行觀察。無必要時，每份樣品只切2張，用O型熒光抗體染色亦可。
    （2）每次檢測應選1~2份陰性淋巴結在相同條件下切片染色和觀察，以作陰性對照。
    （3）每次均應照相保存，以備查考。
    （4）為慎重判定起見，檢出的陽性樣品應凍結保存，并應接種3~5日小白鼠盲傳2~3代，每代72小時撲殺，注意觀察癥狀，最后反向間接血凝診斷液復檢判定。
    （5）采集的淋巴結應新鮮（凍肉內的淋巴結亦可），避免反復凍融，盡量保持樣品細胞的完整性。腐敗變質的淋巴結不宜檢測。
（6）熒光染色前，可用萬分之二的伊文斯蘭染液，浸染1分鐘，立即以PBS洗3次，可降低樣品自發(fā)熒光的強度。

作者: 紀明科    時間: 2009-5-20 11:40
化驗室應用比較好，好多豬場用不到呀！



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