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標題: 雞群抗體檢測 [打印本頁]
作者: lqmin    時間: 2008-12-29 19:21
標題: 雞群抗體檢測
本帖最后由 lqmin 于 2008-12-31 15:05 編輯

今天我準備為我的雞群做一次抗體檢測，因為很久沒做了，我有一些忘了，所以就在論壇上搜索了一下，沒想但居然還沒有，我先等我做完了就發(fā)篇帖子，完善一下。        
紅細胞凝集試驗（HA）與紅細胞凝集抑制試驗（HI）
一.準備
1. 抗凝劑的配制：用天平稱量3.8克檸檬酸三鈉，溶入100ml生理鹽水中，待溶解完全后即可使用。（沒用完的,可放在冰箱4℃保存,使用前要高壓滅菌消毒）
2. .1％紅細胞懸液：由雞心臟或翅靜脈采血，放入加有抗凝劑的離心管內(nèi)（按抗凝劑：全血＝1：2的比例），迅速混勻。在離心機中以3000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，用吸管吸去上清液和紅細胞上層的白細胞薄膜，將沉淀的紅細胞加生理鹽水，慢慢混合均勻，再在離心機中3000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，棄去上清液，再加生理鹽水混勻，如此反復離心4～5次，最后一次離心后的紅細胞，棄去上清液，即為紅細胞泥。放入4℃冰箱中可保存2—3天。使用時用1ml吸管吸取0.1ml紅細胞泥，然后加入9.9ml的生理鹽水，此即1%紅細胞懸液。現(xiàn)用現(xiàn)配。
3. 被檢血清：每只雞心臟或翼下采血0.5-1ml,靜置或離心，待血清析出后備用。(注：我用的是蛋黃,較血清低1個滴度。做法：蛋黃和生理鹽水1：1稀釋，備用)
二.過程
（一）血凝（HA）試驗：采用96孔V型反應(yīng)板，測定抗原效價
1、首先用微量移液器向反應(yīng)板的每孔加生理鹽水25微升。
2、用微量移液器吸取待測抗原25微升于第一孔中并擠壓6次混合，后吸出25微升至第2孔，依次倍比稀釋到第11孔，棄去25微升。
3、微量移液器再吸取1%紅細胞懸液依次加入各孔，每孔25微升。
4、置于微量振蕩器上振蕩1分鐘。
5、室溫靜置30分鐘后觀察結(jié)果。
6、結(jié)果觀察：將反應(yīng)板傾斜成45度角，沉于孔底的紅細胞沿著傾斜面向下呈線狀流動者為沉淀，表明紅細胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔底的紅細胞鋪平孔底，凝成均勻薄層，傾斜后紅細胞不流動，說明紅細胞被病毒所凝集。能使雞紅細胞完全凝集的抗原的最高稀釋倍數(shù)，稱為該抗原滴度紅細胞凝集效價。即沉淀的前一孔即為該抗原的效價。如果到第8孔紅細胞為完全凝集，說明該抗原效價為1：256。

（二）4單位抗原校正：
1、根據(jù)抗原效價結(jié)果配制相應(yīng)比例的抗原稀釋液：即4單位抗原。
例：上圖1：抗原效價為1：256，HI試驗時，25微升抗原稀釋液內(nèi)須含4個凝集單位，則應(yīng)將抗原作256/4=64倍稀釋。即取0.1毫升抗原，加入6.4毫升生理鹽水。
2、首先用微量移液器向反應(yīng)板的第二孔至第六孔加生理鹽水25微升。第一孔不加。
3、用微量移液器吸取4單位抗原25微升分別加入第一孔、第二孔中，從第二孔開始擠壓6次混合，后吸出25微升至第3孔，依次倍比稀釋到第5孔，棄去25微升。
4、用微量移液器再吸取1%紅細胞懸液依次加入1-6孔，每孔25微升。
5、于微量振蕩器上振蕩1分鐘。
6、室溫靜置30分鐘后觀察結(jié)果。
7、結(jié)果觀察：第一、二、三孔為完全凝集，第四孔紅細胞為50%沉淀，第五孔為對照完全沉淀，如果出現(xiàn)以上結(jié)果，表明所配4單位抗原準確，校正成立。
（三）血凝抑制（HI）試驗：每排孔檢查1份血清。步驟如下：
1.用微量移液器先加25微升生理鹽水于各孔中。
2.用微量移液器吸取待檢血清25微升置于第1孔中，然后倍比稀釋至第11孔，棄去25微升。最后一孔不稀釋，為紅細胞對照。
3.用微量移液器吸取配制好的抗原，每孔25微升。
4.置于微量振蕩器上振蕩1分鐘，混合均勻。
5.室溫靜置20分鐘。
6.用微量移液器吸取1%紅細胞懸液于每孔各加25微升。
7.置于微量振蕩器上振蕩1分鐘，混合均勻。
8.室溫靜置40分鐘后觀察結(jié)果。

四、結(jié)果判定：
1）判定結(jié)果：以完全抑制紅細胞凝集的血清最大稀釋度為該血清的HI滴度，以2的指數(shù)表示。

2）判定標準：
1.新城疫抗體：育雛育成雞在7以上，產(chǎn)蛋雞在9以上。
2.H5抗體：抗體值在6以上。
3.H9抗體：抗體值在7以上。
注：低于以上標準，則需要進行免疫。
3)免疫后抗體規(guī)律
一般活疫苗免后7-10天產(chǎn)生抗體，2-3周抗體到達峰值，可以維持2個月。滅活疫苗免后10-15天產(chǎn)生抗體，3-4周抗體到達峰值，可以維持3-4個月。

五、實驗后的用具處理：
1、96孔V型反應(yīng)板的清洗：
新反應(yīng)板可直接放入清潔液中浸泡24小時，用過的反應(yīng)板先用流水沖凈孔中的反應(yīng)物，然后泡在清潔液中，24小時后撈出，甩掉清潔液，放入流水中沖洗干凈后，在蒸餾水中沖洗一遍，甩干，擺放在恒溫箱中，烤干備用。屬塑料制品，70℃以下烤干。
2、微量滴頭的清洗：
新滴頭直接放入清洗液中浸泡，用過的用清水沖洗掉滴頭中的血清后浸泡在清潔液中，最少浸泡24小時，撈出后用流動水沖洗掉滴頭內(nèi)外的清潔液，然后在蒸餾水中沖洗一遍，甩干，放入恒溫箱中烤干，備用。屬塑料制品，70℃以下烤干。
3、吸管及積液槽的清洗：
將吸管及積液槽直接浸泡在清潔液中，24小時后撈出，用流動水沖洗干凈后在蒸餾水中再沖洗一遍，甩干，吸管放入高溫干燥箱中160℃干燥1—2小時后備用，玻璃制品可高溫烤干。積液槽放入恒溫箱中烘干。



            
作者: lqmin    時間: 2008-12-29 19:24
就怕寫不好，讓大家笑話！
只能說是盡力了！
作者: xumurenlq    時間: 2008-12-29 22:05
期待中..........
作者: lqmin    時間: 2008-12-31 14:11
我來發(fā)貼了！紅細胞凝集試驗（HA）與紅細胞凝集抑制試驗（HI）
一.準備
1. 抗凝劑的配制：用天平稱量3.8克檸檬酸三鈉，溶入100ml生理鹽水中，待溶解完全后即可使用。（沒用完的,可放在冰箱4℃保存,使用前要高壓滅菌消毒）
2. .1％紅細胞懸液：由雞心臟或翅靜脈采血，放入加有抗凝劑的離心管內(nèi)（按抗凝劑：全血＝1：2的比例），迅速混勻。在離心機中以3000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，用吸管吸去上清液和紅細胞上層的白細胞薄膜，將沉淀的紅細胞加生理鹽水，慢慢混合均勻，再在離心機中3000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，棄去上清液，再加生理鹽水混勻，如此反復離心4～5次，最后一次離心后的紅細胞，棄去上清液，即為紅細胞泥。放入4℃冰箱中可保存2—3天。使用時用1ml吸管吸取0.1ml紅細胞泥，然后加入9.9ml的生理鹽水，此即1%紅細胞懸液?，F(xiàn)用現(xiàn)配。
3. 被檢血清：每只雞心臟或翼下采血0.5-1ml,靜置或離心，待血清析出后備用。(注：我用的是蛋黃,較血清低1個滴度。做法：蛋黃和生理鹽水1：1稀釋，備用)
二.過程
（一）血凝（HA）試驗：采用96孔V型反應(yīng)板，測定抗原效價
1、首先用微量移液器向反應(yīng)板的每孔加生理鹽水25微升。
2、用微量移液器吸取待測抗原25微升于第一孔中并擠壓6次混合，后吸出25微升至第2孔，依次倍比稀釋到第11孔，棄去25微升。
3、微量移液器再吸取1%紅細胞懸液依次加入各孔，每孔25微升。
4、置于微量振蕩器上振蕩1分鐘。
5、室溫靜置30分鐘后觀察結(jié)果。
6、結(jié)果觀察：將反應(yīng)板傾斜成45度角，沉于孔底的紅細胞沿著傾斜面向下呈線狀流動者為沉淀，表明紅細胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔底的紅細胞鋪平孔底，凝成均勻薄層，傾斜后紅細胞不流動，說明紅細胞被病毒所凝集。能使雞紅細胞完全凝集的抗原的最高稀釋倍數(shù)，稱為該抗原滴度紅細胞凝集效價。即沉淀的前一孔即為該抗原的效價。如果到第8孔紅細胞為完全凝集，說明該抗原效價為1：256。

（二）4單位抗原校正：
1、根據(jù)抗原效價結(jié)果配制相應(yīng)比例的抗原稀釋液：即4單位抗原。
例：上圖1：抗原效價為1：256，HI試驗時，25微升抗原稀釋液內(nèi)須含4個凝集單位，則應(yīng)將抗原作256/4=64倍稀釋。即取0.1毫升抗原，加入6.4毫升生理鹽水。
2、首先用微量移液器向反應(yīng)板的第二孔至第六孔加生理鹽水25微升。第一孔不加。
3、用微量移液器吸取4單位抗原25微升分別加入第一孔、第二孔中，從第二孔開始擠壓6次混合，后吸出25微升至第3孔，依次倍比稀釋到第5孔，棄去25微升。
4、用微量移液器再吸取1%紅細胞懸液依次加入1-6孔，每孔25微升。
5、于微量振蕩器上振蕩1分鐘。
6、室溫靜置30分鐘后觀察結(jié)果。
7、結(jié)果觀察：第一、二、三孔為完全凝集，第四孔紅細胞為50%沉淀，第五孔為對照完全沉淀，如果出現(xiàn)以上結(jié)果，表明所配4單位抗原準確，校正成立。
（三）血凝抑制（HI）試驗：每排孔檢查1份血清。步驟如下：
1.用微量移液器先加25微升生理鹽水于各孔中。
2.用微量移液器吸取待檢血清25微升置于第1孔中，然后倍比稀釋至第11孔，棄去25微升。最后一孔不稀釋，為紅細胞對照。
3.用微量移液器吸取配制好的抗原，每孔25微升。
4.置于微量振蕩器上振蕩1分鐘，混合均勻。
5.室溫靜置20分鐘。
6.用微量移液器吸取1%紅細胞懸液于每孔各加25微升。
7.置于微量振蕩器上振蕩1分鐘，混合均勻。
8.室溫靜置40分鐘后觀察結(jié)果。

四、結(jié)果判定：
1）判定結(jié)果：以完全抑制紅細胞凝集的血清最大稀釋度為該血清的HI滴度，以2的指數(shù)表示。

2）判定標準：
1.新城疫抗體：育雛育成雞在7以上，產(chǎn)蛋雞在9以上。
2.H5抗體：抗體值在6以上。
3.H9抗體：抗體值在7以上。
注：低于以上標準，則需要進行免疫。
3)免疫后抗體規(guī)律
一般活疫苗免后7-10天產(chǎn)生抗體，2-3周抗體到達峰值，可以維持2個月。滅活疫苗免后10-15天產(chǎn)生抗體，3-4周抗體到達峰值，可以維持3-4個月。

五、實驗后的用具處理：
1、96孔V型反應(yīng)板的清洗：
新反應(yīng)板可直接放入清潔液中浸泡24小時，用過的反應(yīng)板先用流水沖凈孔中的反應(yīng)物，然后泡在清潔液中，24小時后撈出，甩掉清潔液，放入流水中沖洗干凈后，在蒸餾水中沖洗一遍，甩干，擺放在恒溫箱中，烤干備用。屬塑料制品，70℃以下烤干。
2、微量滴頭的清洗：
新滴頭直接放入清洗液中浸泡，用過的用清水沖洗掉滴頭中的血清后浸泡在清潔液中，最少浸泡24小時，撈出后用流動水沖洗掉滴頭內(nèi)外的清潔液，然后在蒸餾水中沖洗一遍，甩干，放入恒溫箱中烤干，備用。屬塑料制品，70℃以下烤干。
3、吸管及積液槽的清洗：
將吸管及積液槽直接浸泡在清潔液中，24小時后撈出，用流動水沖洗干凈后在蒸餾水中再沖洗一遍，甩干，吸管放入高溫干燥箱中160℃干燥1—2小時后備用，玻璃制品可高溫烤干。積液槽放入恒溫箱中烘干。
作者: 李業(yè)明    時間: 2010-3-24 16:43
寫的很好??！謝謝分享??！
作者: 波浪    時間: 2010-4-1 20:09
謝謝樓主分享，正需要這方面的資料。不錯，學習了。
作者: stongqingqing    時間: 2010-4-17 14:03
先前還迷糊呢，不知道怎么判定，現(xiàn)在一看全明白了
作者: noah    時間: 2010-6-4 21:58
寫的不錯，但實際中抗體的沒有這么高啊
作者: chengdunykjxy    時間: 2010-6-16 00:00
做抗體要的實驗室環(huán)境還是要講究一下，這樣做出來的水平才更加的準確。
作者: noah    時間: 2010-6-18 15:36
4單位抗原的制備很重要，你說的好像不太對吧



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