畜牧人

標(biāo)題: 產(chǎn)蛋白酶菌株枯草芽孢桿菌的分離 [打印本頁(yè)]
作者: zhenzuyulu    時(shí)間: 2010-6-11 12:08
標(biāo)題: 產(chǎn)蛋白酶菌株枯草芽孢桿菌的分離
枯草桿菌是屬于芽孢桿菌屬的一類(lèi)細(xì)菌。枯草芽孢桿菌的分布十分廣泛，主要存在于土壤或腐爛的稻草之中。由于能夠形成芽孢，因此能夠抵抗高溫，低溫等不良環(huán)境，所以是實(shí)驗(yàn)室及工業(yè)生產(chǎn)中主要污染菌之一，危害極大。但是許多枯草芽孢桿菌能分泌蛋白酶、淀粉酶、抗菌素等物質(zhì)，是工業(yè)酶制劑生產(chǎn)的重要菌種。例如，我國(guó)使用的BF7658枯草芽孢桿菌生產(chǎn)а-淀粉酶，用于淀粉水解，紡織品退漿等。又如AS1398枯草桿菌是生產(chǎn)蛋白酶的重要菌株。
1. 枯草芽孢桿菌的芽孢耐熱的特點(diǎn)。
由于芽孢具有較強(qiáng)的抗高溫能力，分離純化時(shí)可采用熱處理的方法，即通過(guò)高溫加熱殺死其中不生芽孢的菌種，使耐熱的芽孢菌得到富集。
2. 枯草芽孢桿菌的產(chǎn)酶特征。
利用枯草芽孢桿菌產(chǎn)生水解酶的特性，可以選擇酪蛋白或淀粉為主要營(yíng)養(yǎng)成分的分離培養(yǎng)基，因菌體分泌的酶可以將大分子的蛋白或淀粉水解而在菌落周?chē)纬赏该魅?。根?jù)透明圈直徑(H)和菌落直徑(C)之比值(H/C)可以初步確定酶活力，其比值越大，酶活力越高，進(jìn)而可篩選出高產(chǎn)酶活的菌株。
3. 枯草芽胞桿菌的形態(tài)特征
枯草芽孢桿菌的細(xì)胞大小0.7×2～3 μm，營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞為桿狀，桿端鈍圓、單生或者短鏈，著色均勻，無(wú)莢膜，周邊運(yùn)動(dòng)，革蘭氏染色陽(yáng)性。有芽孢0.6×1～1.5 μm，芽孢中生或近中生，壁薄，不膨大，孢子呈橢圓或長(zhǎng)筒形，常為兩端染色。菌落變化很大，枯草芽孢桿菌在麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基斜面上，菌落呈細(xì)皺狀，干燥或顆粒狀。在土豆培養(yǎng)基上菌落呈細(xì)皺狀，干燥，有時(shí)呈現(xiàn)天鵝絨狀的菌苔，在液體培養(yǎng)基表面形成銀白色的菌膜。菌落粗糙，扁平、擴(kuò)展，不透明，不閃光，表面干燥，污白色或微帶黃色。
4. 枯草芽胞桿菌的生理生化特性
    枯草芽孢桿菌能夠液化明膠，凍化牛乳，還原硝酸鹽，不產(chǎn)生吲哚，H2S，V-P反應(yīng)陽(yáng)性，水解淀粉。1. 樣品：  從地表下10~15cm的土壤或者枯枝爛葉、腐爛稻草中用無(wú)菌小鏟、紙袋取土樣，
并記錄取樣的地理位置、pH、植被情況等。（學(xué)生自取）
2. 培養(yǎng)基
① 肉湯培養(yǎng)基（附錄Ⅱ-1.1）：100 mL/組，其中20 mL液體培養(yǎng)基/250 mL△中（內(nèi)裝玻璃珠10顆）；50 mL固體斜面培養(yǎng)基分裝在試管中：5mL/支，10支。
組成： 牛肉膏0.5%   蛋白胨1%  NaCl 0.5%  pH 7.2～7.4  121℃，滅菌20min
② 酪素培養(yǎng)基（附錄Ⅱ-1.10）：200 mL/500 mL△×1（10-12個(gè)平板，每組6個(gè)平板）
組分        配方要求(%)        母液濃度(%)        各成分的取量（mL）/200ml
KH2PO4        0.036        3.6        2
MgSO4•7H2O        0.05        5        2
ZnCl2        0.0014        0.14        2
Na2HPO4•7H2O        0.107        10.7        2
NaCl        0.016        1.6        2
CaCl2        0.0002        0.02        2
FeSO4        0.0002        0.02        2
*酪素        0.4        4        20
Trypticase        0.005        0.5        2
瓊脂        2.0               
* 酪素的母液濃度為4%，是將4g干酪素溶解于0.1N的30-35ml的NaOH水溶液中，水浴溶解20min，待溶解完全后加入60-70℃熱水稀釋到所需濃度（即定容到100 mL），即得到母液濃度圍4%的酪素溶液。
各組分的母液由老師配制好，學(xué)生按照200ml的體積直接取樣加入即可。
pH 6.5～7.0，121℃，滅菌20min，倒好平板后進(jìn)行無(wú)菌檢查。
③ 生理鹽水：0.85% NaCl水溶液，9 mL/支×10支
④ 其他：平皿10套、溫度計(jì)、水浴鍋、移液管、顯微鏡、涂布器2個(gè)，三角瓶（250mL， 500 mL規(guī)格）、革蘭氏染色液等。   
四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容
1.采樣
學(xué)生從地表下10～15cm的土壤中用無(wú)菌小鏟，紙袋取土樣，并記錄取樣的地理位置、pH、植被情況等等。
2. 增殖培養(yǎng)（富集培養(yǎng)）
一般來(lái)講，樣品所占欲分離微生物的數(shù)量較少，利用微生物所需營(yíng)養(yǎng)的區(qū)別，在增殖培養(yǎng)基中使某些微生物的生長(zhǎng)受到抑制，而對(duì)某些微生物可促進(jìn)它們的生長(zhǎng)，從而達(dá)到分離所需微生物的目地，這種培養(yǎng)稱(chēng)為增殖培養(yǎng)。
取土樣平攤于一干凈的紙上，從四個(gè)角和中央各取一點(diǎn)土，混勻，稱(chēng)取1g，置于裝有20ml肉湯培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，六層紗布封口，于80℃水浴加熱處理10min，以殺死樣品中的微生物營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞。然后30℃，150 r/min，振蕩培養(yǎng)24h。取樣鏡檢形成芽孢的情況。
3. 涂布分離
將增殖培養(yǎng)液置于80℃水浴中加熱10min，再次殺死不形成芽孢的營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞，以濃縮芽孢桿菌（第二次加熱處理前，取1ml培養(yǎng)液經(jīng)適當(dāng)稀釋后作革蘭氏染色，觀察是否有枯草芽孢桿菌存在，本實(shí)驗(yàn)中略去該步驟）。
然后取1 mL處理液以10倍稀釋法分別稀釋到10-4，10-5，10-6等。分別取0.1mL菌液于無(wú)菌的酪素培養(yǎng)基平板上（初篩平板，每個(gè)稀釋度平均兩皿），用滅過(guò)菌的涂布棒將菌液均勻涂布在酪素平板上，倒置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24~48h。觀察酪素平板上菌落周?chē)耐该魅?，?H/C)比值大的菌接入斜面培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)24h，備用。
4. 純化
   用平板劃線(xiàn)分離法在酪素平板或牛肉膏蛋白胨平板上分離純化挑選出的菌株。
5. 純種鑒定
   菌種經(jīng)革蘭氏染色，油鏡觀察，從細(xì)胞形態(tài)及菌落特征進(jìn)行鑒別。
  ① 細(xì)胞形態(tài)，菌落特征，芽孢形成情況。
  ② 產(chǎn)蛋白酶能力的測(cè)定：直接觀察在酪素平板上菌落周?chē)纬傻耐该魅Α?br /> 6.菌種保藏   該實(shí)驗(yàn)分離得到的枯草芽孢桿菌作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的菌種使用。
葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，需氧，適溫25～31℃生長(zhǎng)。
作者: liwei986yc    時(shí)間: 2010-6-11 12:37
感謝分享！
作者: qw4137    時(shí)間: 2010-6-21 14:26
謝謝分享~~~~··~~~··



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