畜牧人

標(biāo)題: 飼料木聚糖酶的開發(fā) [打印本頁]

作者: luyafei414 時(shí)間: 2010-10-5 11:00
標(biāo)題: 飼料木聚糖酶的開發(fā)
　　飼料木聚糖酶的開發(fā)
　　摘要木聚糖是動(dòng)物飼料中的抗?fàn)I養(yǎng)因子之一，飼料中添加木聚糖酶可以為畜禽生產(chǎn)帶來良好的生產(chǎn)效果和經(jīng)濟(jì)效益，具有十分重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義，開發(fā)木聚糖酶市場前景廣闊。文中簡單介紹了木聚糖酶及其在動(dòng)物營養(yǎng)中的應(yīng)用和飼料木聚糖酶開發(fā)的途徑;介紹了基因工程和蛋白質(zhì)工程方法在木聚糖酶開發(fā)中的應(yīng)用;重點(diǎn)介紹了蛋白質(zhì)工程在開發(fā)熱穩(wěn)定性木聚糖酶方面的研究概況。
　　關(guān)鍵詞木聚糖酶;飼料開發(fā);蛋白質(zhì)工程
　　中圖分類號(hào) S816.35
　　近年來，隨著人們對畜產(chǎn)品品質(zhì)安全衛(wèi)生的要求，開發(fā)使用高品質(zhì)無毒、無害和無污染殘留的綠色飼料添加劑已成為我國飼料工業(yè)面臨的一個(gè)緊迫問題。中國飼料產(chǎn)量位居世界第二，然而飼料資源并不豐富，其中能量飼料缺口較大，據(jù)預(yù)測2020年將達(dá)0.83億噸[1]。規(guī)?；B(yǎng)殖的發(fā)展，使充分利用非常規(guī)飼料資源成為畜牧業(yè)長期、持續(xù)和健康發(fā)展的關(guān)鍵。我國長期以玉米為主要能量飼料原料的現(xiàn)狀造成玉米供應(yīng)日趨緊張，因此必須充分地開發(fā)利用資源豐富的麥類、谷物和糠麩。但麥類、谷物和糠麩等副產(chǎn)品中都存在抗?fàn)I養(yǎng)因子——阿拉伯木聚糖，限制了其在飼料中的大量應(yīng)用。
　　隨著生物技術(shù)的發(fā)展，飼用酶制劑和微生物制劑的產(chǎn)量得到了快速增長，質(zhì)量也有了顯著提高，酶制劑可以提高飼料利用率、促進(jìn)動(dòng)物生長、改善生態(tài)環(huán)境和防治動(dòng)物疾病，避免了由于添加抗生素、激素和高銅等物質(zhì)所產(chǎn)生的負(fù)面影響，具有明顯的經(jīng)濟(jì)效益和積極的環(huán)保意義。我國飼料行業(yè)，在配合飼料中除一般玉米—豆粕型日糧，實(shí)際上更多的情況是在玉米—豆粕型日糧基礎(chǔ)上可能加入10%~40%的大麥或小麥、次粉、麥麩、統(tǒng)糠、棉粕等非常規(guī)飼用原料，這使得木聚糖酶在飼料工業(yè)中占有重要地位[2]。另外，中國已加入WTO，國外低價(jià)格小麥、大麥產(chǎn)品的涌入，將進(jìn)一步刺激木聚糖酶的市場需求。添加以木聚糖酶為主的飼用酶制劑，消除抗?fàn)I養(yǎng)因子的抗?fàn)I養(yǎng)作用，市場前景極為廣闊。
　　1 木聚糖酶的營養(yǎng)作用及其在動(dòng)物營養(yǎng)中的應(yīng)用
　　木聚糖在植物細(xì)胞壁中的含量僅次于纖維素，是半纖維素中含量最豐富的一種，約占細(xì)胞干重的35%[3],是谷物籽實(shí)中的主要非淀粉多糖(NSP)之一，它的存在使谷物中的營養(yǎng)物質(zhì)不能被充分暴露于動(dòng)物消化液的表面，進(jìn)而影響動(dòng)物的消化吸收，降低了飼料的營養(yǎng)價(jià)值。木聚糖酶類是專一降解木聚糖的一類，它在生物轉(zhuǎn)化、食品、飼料、醫(yī)藥、能源、造紙、紡織等行業(yè)中有著廣泛的應(yīng)用[4]，具有很大的商業(yè)開發(fā)價(jià)值。它可以破壞植物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，提高內(nèi)源性消化酶的活性，提高飼料養(yǎng)分的利用率;降解可溶性多糖，降低其粘性;減少胃腸道疾病，增進(jìn)動(dòng)物健康;減少粘糞和臟蛋，降低空氣中有害氣體濃度，減少環(huán)境污染[5]。飼料工業(yè)中添加木聚糖酶可以為畜禽生產(chǎn)帶來良好的生產(chǎn)效果和經(jīng)濟(jì)效益。許多試驗(yàn)表明，添加木聚糖酶可以提高畜禽的生產(chǎn)性能[6-8]。但也有效果不明顯甚至沒有效果的報(bào)道。這些資料顯示生產(chǎn)成績與日糧類型和動(dòng)物生理?xiàng)l件等因素間存在相關(guān)性[9，10]。
　　2 木聚糖酶的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和生化特性
　　對不同來源的木聚糖酶的研究已證實(shí)了木聚糖酶的多樣性[11]。木聚糖的完全降解需要木聚糖水解酶系中各種酶相互協(xié)同完成,其中內(nèi)切木聚糖酶是最關(guān)鍵的水解酶。以氨基酸序列相似性和疏水簇分析法為基礎(chǔ)，Henrissat和Bairoch(1993,1996)[12]將糖基糖苷鍵水解酶中的內(nèi)切木聚糖酶分為10族和11族，這相當(dāng)于Gilkes(1991)[13]等分類的第F家族和第G家族，它們分別組成高分子量和低分子量的木聚糖酶。10族內(nèi)切木聚糖酶主要包括酸性和大分子的內(nèi)切木聚糖酶，而堿性的和小分子的內(nèi)切木聚糖酶則屬于11族。在結(jié)構(gòu)上木聚糖酶有催化結(jié)構(gòu)域、底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域、熱穩(wěn)定結(jié)構(gòu)域、Cellulosome-Docking結(jié)構(gòu)域、連接區(qū)域、重復(fù)序列和其它未知功能的非催化結(jié)構(gòu)域以及催化結(jié)構(gòu)域[14]，不同的木聚糖酶含有其中的一個(gè)或一個(gè)以上的區(qū)域。
　　細(xì)菌和真菌的β-1，4-木聚糖酶多數(shù)為單亞基蛋白，對于不同生物來源的木聚糖酶，分子量(Mr)范圍為8~145kD，pH范圍為3~10.5，穩(wěn)定pH范圍為3~10，多數(shù)酶的最適pH范圍為4~7，最適溫度為40~60℃。根據(jù)酶的理化特性，可分為兩大類，即Mr小于30kD的酶和Mr大于30kD的酶。70%的酸性β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶Mr在30kD以上，而堿性β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶Mr則多在30kD以下。通常細(xì)菌可產(chǎn)生兩種木聚糖酶，即低Mr的堿性木聚糖酶和高M(jìn)r的酸性木聚糖酶，但真菌通常只產(chǎn)生低Mr的堿性木聚糖酶[15]。
　　3 飼料木聚糖酶的開發(fā)途徑
　　木聚糖酶要廣泛經(jīng)濟(jì)高效的應(yīng)用于飼料工業(yè)應(yīng)具備一定條件。眾所周知，豬胃中的pH一般為2~3.5，十二指腸、空腸和回腸的pH范圍分別為4~6、5.5~6.7和7.0~7.5[16]，因此要求飼用木聚糖酶在pH較廣的范圍內(nèi)能保持較高的活性。另一方面，現(xiàn)在顆粒料制粒過程中有一個(gè)短暫的高溫過程，溫度在75~93℃，多數(shù)木聚糖酶在此高溫下會(huì)大幅度地喪失活性[17];同時(shí)，飼料中的木聚糖酶最終的作用場所是豬正常體溫(37℃)的胃腸中，因此能耐制粒高溫，且在動(dòng)物正常體溫下具有較高活性成為木聚糖酶在生產(chǎn)中應(yīng)用的關(guān)鍵。
　　目前，在飼料工業(yè)中使用的酶制劑基本上是由微生物發(fā)酵生產(chǎn)的，發(fā)酵結(jié)束后獲得的含酶發(fā)酵液需要經(jīng)過一系列后處理操作，分離菌體，加工成干物質(zhì)，或者加入各種穩(wěn)定劑才能應(yīng)用在飼料生產(chǎn)中。在飼用酶的應(yīng)用中，穩(wěn)定性是影響應(yīng)用效果的重要因素。目前已經(jīng)可以通過改進(jìn)生產(chǎn)工藝如加鹽、制備包被型含酶顆粒等使木聚糖酶的穩(wěn)定性得以提高[18-21]，但是主要的技術(shù)指標(biāo)——發(fā)酵酶活在很大程度取決于產(chǎn)酶菌種的性能和酶本身，目前普遍采用的包被等技術(shù)不能從根本上提高酶的熱穩(wěn)定性，而基因工程和蛋白質(zhì)工程的發(fā)展為改造木聚糖酶特性提供了新手段。
　　3.1 木聚糖酶基因克隆與表達(dá)的研究概況
　　到目前為止，已有近百種不同菌株的木聚糖酶基因被克隆或表達(dá)出來，其中細(xì)菌來源的木聚糖酶克隆較多，但真菌來源的木聚糖酶克隆很少。這些研究多采用大腸桿菌為宿主菌[22]，也有以酵母、木霉、曲霉等真核生物為受體細(xì)胞的[17]，而所運(yùn)用的載體及限制酶則形式多樣?？寺〉哪揪厶敲富蛞话闶褂米陨硭鶖y帶的啟動(dòng)子在受體菌中表達(dá)，但是酶的表達(dá)水平比在原始菌株中下降了許多，原來能分泌到細(xì)胞外的酶也只有少數(shù)在新的受體中能繼續(xù)維持分泌性能。由于克隆的木聚糖酶基因表達(dá)水平比在原始菌株中低，從有利于生產(chǎn)及進(jìn)一步提高表達(dá)水平的角度出發(fā)，許多科學(xué)家嘗試?yán)梅置谛缘难挎邨U菌、鏈霉菌、曲霉等作為生物反應(yīng)器[23]，并使用具有高效表達(dá)啟動(dòng)子的載體構(gòu)建新型高效表達(dá)基因工程菌，不僅提高了酶活性，而且有些木聚糖酶能分泌到胞外[24]。一般采用CaCl2處理法或電穿孔法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到受體細(xì)胞，用RBB木聚糖(Remazol Brilliant Blue-Xylan)平板進(jìn)行篩選，也有利用與可可堿酸鈉偶聯(lián)的木聚糖(AZCL-Xylan)為底物進(jìn)行檢測的，還有的用剛果紅染色進(jìn)行篩選。
　　3.2 蛋白質(zhì)工程改造木聚糖酶
　　蛋白質(zhì)工程是在重組DNA方法用于“操縱”蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)之后發(fā)展起來的一個(gè)分子生物學(xué)分支，它通過修飾蛋白質(zhì)的基因或改變結(jié)構(gòu)來獲得具有新特性的蛋白質(zhì)[25]。人們試圖利用已有的結(jié)構(gòu)生物學(xué)信息對蛋白質(zhì)進(jìn)行合理設(shè)計(jì)(rational design)，在蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)和功能研究的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)一個(gè)新的具有人們所期待性質(zhì)的蛋白質(zhì)氨基酸序列，然后通過對編碼該蛋白質(zhì)的基因進(jìn)行定位突變或盒式突變，再用遺傳工程的方法產(chǎn)生出預(yù)期的新的蛋白質(zhì)。但蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性極大地增加了難度，況且多數(shù)要改造的蛋白質(zhì)我們并不清楚其結(jié)構(gòu)，不能進(jìn)行合理設(shè)計(jì)。而隨著分子遺傳學(xué)的發(fā)展，作為非合理設(shè)計(jì)(irrational design)的分子定向進(jìn)化策略可沖破這一局限性[26]，可以在未知目標(biāo)蛋白三維結(jié)構(gòu)信息和作用機(jī)制的情況下，在體外模擬自然進(jìn)化的過程(隨機(jī)突變、重組和選擇)。通過對編碼基因的隨機(jī)突變、重組和定向篩選，獲得具有改進(jìn)功能或全新功能的蛋白質(zhì)，使幾百萬年的自然進(jìn)化過程在短期內(nèi)得以實(shí)現(xiàn)，在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改造中具有極大的潛力。
　　3.2.1 定點(diǎn)突變技術(shù)
　　定點(diǎn)突變技術(shù)是利用合成的寡核苷酸作誘變物，根據(jù)設(shè)計(jì)的方案，在已知的核苷酸序列中準(zhǔn)確地改變蛋白質(zhì)氨基酸編碼中一個(gè)或數(shù)個(gè)堿基，改變組成蛋白質(zhì)的一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸殘基，以研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。
　　人們從嗜熱性微生物如細(xì)菌、真菌和放線菌中發(fā)現(xiàn)了許多木聚糖酶，它們具有很高的熱穩(wěn)定性，且其催化結(jié)構(gòu)域有較大同源性。以催化結(jié)構(gòu)域的保守殘基分析為基礎(chǔ)進(jìn)行定點(diǎn)突變改變木聚糖酶性質(zhì)，如酶活性，熱穩(wěn)定性，pH值穩(wěn)定性等，這些酶在工業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用具有十分重要的意義。Georis等[27]建立了木聚糖酶xyl1和TfxA的分子模型，這兩種木聚糖酶分別來自于中溫菌Streptomyces sp.S38和嗜熱菌Termomonospora fusca，都屬于第11家族的木聚糖酶。比較了這2種木聚糖酶的三維結(jié)構(gòu)，并將TfxA酶中的嗜熱結(jié)構(gòu)用定點(diǎn)突變法引入xyl1酶中，以提高其最適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性。將xyl1的11位的蘇氨酸殘基突變?yōu)槔野彼?T11Y)，從而在第11位酪氨酸和第16位酪氨酸之間(Y11-Y16)建立一個(gè)和TfxA酶一樣的新的芳香族氨基酸相互作用，結(jié)果突變酶的最適溫度由原來的60℃提高到70℃，57℃時(shí)酶的熱穩(wěn)定性比原來提高了6倍。進(jìn)一步對突變的酶分子xyl1進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，Y11和Y16分別位于β鏈的β1和β2上。它們之間的相互作用增加了xyl1分子氨基末端的穩(wěn)定性。Roberge等[28]用定點(diǎn)突變法研究Streptomyces lividans木聚糖酶A的His86殘基對酶熱穩(wěn)定性的影響，用定點(diǎn)突變法將His86分別突變成6種其它的氨基酸殘基，所有這些突變都使酶的熱穩(wěn)定性大大降低。可見，His86是木聚糖酶A耐熱必需的氨基酸。Tumnen等[29]報(bào)道將Trichoderma reesei的木聚糖酶II的一個(gè)α-螺旋的162位谷氨酰胺突變?yōu)榻M氨酸或酪氨酸后半衰期提高到63min。他們還研究了該酶的活性中心表面增加精氨酸殘基后對酶活和酶的穩(wěn)定性的影響[30]，將5個(gè)精氨酸殘基引入到“Ser/Thr表面”(Ser/Thr surface)中，結(jié)果Ser/Thr表面的精氨酸使酶在較高的溫度下的活性提高了，在有底物的情況下，木聚糖酶在60~65℃時(shí)的熱穩(wěn)定性提高了4~5倍。原因可能是精氨酸的引入使得離子鍵的數(shù)目增加，從而增加了酶的pH和熱穩(wěn)定性。Moreau等(1999)[31]用定點(diǎn)誘變技術(shù)將Streptomyces lividans 1326的木聚糖酶XYLA中的Arg156變成Glu，結(jié)果R156E的特異性酶活性提高了10%至25%，最適溫度比野生型提高了5℃，半衰期提高了6min，提高幅度為47%，而突變酶酶反應(yīng)的pH性質(zhì)與天然酶相同。
　　3.2.2 引入二硫鍵
　　研究發(fā)現(xiàn)，在酶蛋白中引入半胱氨酸，從而增加酶蛋白中二硫鍵的數(shù)量可以增加某些酶的穩(wěn)定性，但不影響酶的活性。Tumnen等[33]報(bào)道將Trichoderma reesei的木聚糖酶II的一個(gè)α-螺旋中的110位絲氨酸和154位的天冬氨酸分別突變?yōu)榘腚装彼幔瑥亩?10位和154位建立一個(gè)二硫鍵， 65℃時(shí)的半衰期從不到1min增加到14min。1994年，Wakarchuk等[34]在木聚糖酶分子中引入不影響其活性的二硫鍵，使其耐熱性提高了15℃。
　　3.2.3 蛋白質(zhì)體外定向進(jìn)化
　　蛋白質(zhì)(或酶)的體外定向進(jìn)化(directed evolution of protein or enzyme in vitro)，又稱分子進(jìn)化(molecular evolution)，就是人為地創(chuàng)造特殊的進(jìn)化條件，模擬自然進(jìn)化機(jī)制(隨機(jī)突變、重組和自然選擇)，在體外對蛋白質(zhì)(或酶)基因進(jìn)行隨機(jī)誘變，用一定的篩選或選擇方法定向選出所需性質(zhì)的突變酶。目前已發(fā)展出多種定向進(jìn)化的策略，如易錯(cuò)PCR(erro-prone PCR)、DNA重排(DNA shuffing)、體外隨機(jī)引發(fā)重組(random-priming in vitro recombination,PRP)、交錯(cuò)延伸(stagger extension process，StEP)等[35，36]。其中DNA改組技術(shù)，又稱有性PCR(sexal PCR)，在蛋白質(zhì)的體外定向進(jìn)化中起著重要的作用，它不僅可以加速積累有益突變，而且可以使酶的兩個(gè)或更多的已優(yōu)化性質(zhì)合為一體[37]。
　　4 前景與展望
　　綜上所述，木聚糖酶具有廣泛的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值，開發(fā)木聚糖酶可以緩解我國飼料資源的不足，變廢為寶，提高飼料的可消化性和動(dòng)物的生產(chǎn)性能。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，可以通過改進(jìn)生產(chǎn)工藝，利用基因工程、蛋白質(zhì)工程等生物技術(shù)手段，來高效地生產(chǎn)高酶活、適應(yīng)性、抗逆性強(qiáng)的木聚糖酶，以實(shí)現(xiàn)其低成本、產(chǎn)業(yè)化的商品生產(chǎn)。而對木聚糖酶在各種動(dòng)物不同時(shí)期飼喂不同日糧時(shí)作用模式的研究，酶的最佳用量和最佳活力環(huán)境的確定、酶活性測定方法的統(tǒng)一以及我國飼料中木聚糖含量數(shù)據(jù)庫的建立都是我們以后還需努力的方向[3]?？傊揪厶敲副貙⒃谖磥淼男竽翗I(yè)發(fā)展中，發(fā)揮出其所具有的巨大潛力和作用。(鐘茂謝和芳)

作者: chezhengquan 時(shí)間: 2010-10-5 21:39
辛苦了，收藏

作者: youzaitianya 時(shí)間: 2010-10-5 22:36
質(zhì)量懸殊太大酶制劑市場目前很混亂尤其飼用酶沒有標(biāo)準(zhǔn)

[ts]youzaitianya 于 2010-10-5 22:37 補(bǔ)充以下內(nèi)容[/ts]

質(zhì)量懸殊太大酶制劑市場目前很混亂尤其飼用酶沒有標(biāo)準(zhǔn)

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