畜牧人
標(biāo)題: O78型鴨大腸桿菌的分離鑒定及免疫試驗 [打印本頁] 作者: xiaomeng_024 時間: 2011-2-24 16:29標(biāo)題: O78型鴨大腸桿菌的分離鑒定及免疫試驗取菌種，用滅菌接種環(huán)致密劃線于瓊脂平板表面，用無菌鑷子將各種抗菌藥物圓紙片分別貼于培養(yǎng)基表面，各片距離要相等 37 ℃ 培養(yǎng)24小時觀察結(jié)果。
1.2.4 血清學(xué)鑒定
挑取麥康凱上的菌，以馬丁肉湯擴大培養(yǎng)， 12 1 ℃滅活30min,用禽源大腸桿菌O型單因子血清進行平板凝集反應(yīng)。
毒力試驗摘要 ： 2008 年從四川某鴨廠發(fā)生的以心包炎肝周炎為特征的病鴨群中分離獲得 1 株革蘭氏陰性桿菌，定名為 SC-2008 。經(jīng)分離培 養(yǎng)、形態(tài)學(xué)檢查、生理生化試驗、血清學(xué)鑒定、毒力實驗，分離菌株被鑒定為 O78 型鴨大腸桿菌。用該菌株進行液體培養(yǎng)制備的油乳劑滅活疫苗，可使鴨獲得較好的免疫力，能有效的預(yù)防本病的發(fā)生。
關(guān)鍵詞 ：鴨大腸桿菌；鑒定；免疫
大腸桿菌可引起鴨敗血性傳染病，病鴨病變特征為心包炎、肝周炎、氣囊炎等，近年隨著規(guī)?；B(yǎng)鴨業(yè)的不斷發(fā)展，鴨大腸桿菌病的發(fā)生有越來越嚴重的趨勢，成為目前危害養(yǎng)鴨業(yè)最嚴重的傳染病之一。
1 材料與方法
1.1 材料
培養(yǎng)基：麥康凱和改良馬丁，自制；病鴨來源：四川；生化反應(yīng)管：杭州微生物試劑有限公司
1.2 方法
1.2.1 細菌學(xué)檢查
根據(jù)臨床癥狀、發(fā)病鴨剖檢，主要病理變化有心包炎、肝周炎、膽囊充盈、全身敗血癥。無菌采取該鴨的腦和肝臟，常規(guī)處理，在麥康凱和改良馬丁上劃線，放入 37 ℃ 培養(yǎng)箱培養(yǎng) 24h ，鏡檢后，挑選單個菌落 , 繼續(xù)劃線培養(yǎng)。 挑取麥康凱平板上的單一菌落，按常規(guī)方法進行革蘭氏染色。
1.2.2 生化試驗
取細菌的純培養(yǎng)物分別接于微量發(fā)酵管， 3 7 ℃ 培養(yǎng)24小時，觀察結(jié)果。
1.2.3 藥敏試驗
1.2.5
1.2.5.1 半數(shù)致死量
將菌液稀釋至16×104CFU, 8×104CFU, 4×104CFU, 2×104CFU, 1×104CFU, 0.5×104CFU和 0.25×104CFU細菌，將19日齡肉鴨隨機分成8組，每組5只，分別于腿部肌肉攻毒1ml/只，生理鹽水設(shè)為對照組。
1.2.5.2 哺乳動物接種試驗
1.2.5.3 SPF 雞接種試驗
取 15 只 21 日齡 SPF 雞，隨機分成三組，將菌液稀釋成 2.5 ×105CFU ， 1 ×106CFU ， 5 ×106CFU ，肌肉注射， 1 ml/ 只。
1.2.6 疫苗制備
1.2.6 .1 菌液制備
將細菌接種到液體改良馬丁培養(yǎng)基，于 37 ℃ 搖床培養(yǎng)7h，活菌計數(shù)，將菌液加入4‰的甲醛于 3 7 ℃ 滅活24小時，將菌進行無檢、安檢。
1.2.6 .1 滅活疫苗的制備
取滅活后檢驗合格的菌液加吐溫-80制成水相，與混合油相一起乳化制備滅活疫苗。
1.2.6 .2 疫苗性狀測定
對制備的油乳劑滅活苗進行物理性狀檢驗、劑型試驗、穩(wěn)定性試驗、有效期測定等。
1.2.6.3 滅活疫苗效力檢驗
用試制的疫苗皮下接種于 5 日齡健康易感肉鴨 40 只， 0.3ml/ 只（含一個免疫劑量），于免疫后 7d 、 10d 、 14d 、 28d ，分別隨機選取 10 只攻毒，另選 10 只未免疫做空白對照，攻 50 倍半數(shù)致死量的量，計算保護率。
2 結(jié)果
2.1 菌體形態(tài)
接種麥康凱培養(yǎng)基平板上， 3 7 ℃ 培養(yǎng)24小時，肉眼觀察為粉紅色，隆起，表面光滑邊緣整齊的S型菌落。 代次間菌落大小，光滑度，隆起度，色澤度，邊緣整齊度肉眼看不出差別。涂片為革蘭氏陰性，兩端鈍圓的桿菌。
2.2 生化試驗
鳥氨酸（ + ）、 甘露糖（ + ） 、 甘露醇（ + ） 、 木糖（ + ） 、 阿拉伯糖（ + ） 、 果糖（ + ） 、 山梨糖（ + ） 、 鼠李糖（ + ） 、 半乳糖（ + ） 、 棉子糖（ + ） 、 麥芽糖（ + ） 、 葡萄糖（ + ） 、 乳糖（ + ） 、 山梨醇（ + ） 、 水楊素（—） 、 七葉苷（—） 、 枸櫞酸（—） 、 硫化氫（—） 、 蔗糖（—） 、 木糖醇（—） 、 衛(wèi)茅醇（—） 、 肌醇（—） 、 側(cè)金盞（—） 、 明膠 2 2 ℃ （—） 、 糊精（—） 、 尿素（—）。從結(jié)果上看 100% 符合大腸桿菌的生化特性。
2.3 藥敏試驗
共做了 38 種藥敏片，主要是氨基糖苷類敏感，其余都有或多或少的耐藥性
有效果的主要為：
2.4 血清學(xué)鑒定
O78 血清凝集為陽性
2.5 動物攻毒
2.5.1 半數(shù)致死量
經(jīng)計算： LD50=0.37 萬 / 只， MLD=4 萬 / 只
2.5.2 哺乳動物接種試驗
攻毒 16h 小白鼠和豚鼠死亡， 40h 兔子死亡， 兔子在攻毒 16h 體溫平均升高 2 ℃， 對照健存。均出現(xiàn) 皮下出血，肝臟出血，腸道出血，水腫，膠凍樣，心臟冠狀出血，肺臟出血，胰臟出血，胃出血。取肝臟和心臟細菌分離，均分出大腸桿菌。
2.5.3 SPF 雞接種試驗
48 小時均出現(xiàn)癥狀，注射 1 ×106CFU ， 5 ×106CFU ，雞在 96 小時發(fā)生死亡，對照正常，剖檢均有腿部 肌肉出血，心包炎，肝周炎，腸道出血，肺臟出血，氣囊混濁膽囊充盈， 取肝臟和心臟細菌分離，均分出大腸桿菌。
2.6 疫苗制備
2.6.1 疫苗性狀測定
該油苗為乳白色乳劑 , 劑型為油包水型。以 3 000 r/min 離心 15 min, 疫苗不出現(xiàn)分層現(xiàn)象；在
37 ℃ 左右條件下放置 21 d ，不破乳； 2~ 8 ℃ 及室溫存放 6 個月，基本不出現(xiàn)分層現(xiàn)象。保存期測定， 2~ 8 ℃ 冷藏保存，有效期為 1 年；粘度測定時間為 3.6 s ，適于注射。
2.6.2 免疫產(chǎn)生期和免疫持續(xù)期試驗
免疫 7d 保護率即達到 100% 保護，對照鴨全部死亡。到 28d 保護率未發(fā)生變化。
3 討論
3.1 對分離的細菌進行形態(tài)觀察、生化試驗及血清學(xué)鑒定為 O78 型大腸桿菌，據(jù)報道，與禽病有關(guān)的大腸桿菌最常見的是 O1 、 O2 、 O35 、 O78 等 [1] 。此株菌可用于制備流行株的疫苗。
3.2 分離出大腸桿菌 O78 對鴨、雞、小白鼠、豚鼠和兔子具有較高的毒力，在生物學(xué)上應(yīng)引起重視。
3.3 由于大腸桿菌帶有可傳導(dǎo)的抗藥性質(zhì)粒和菌株 [2] ，加上大腸桿菌病防治中，抗生素的普遍使用，使得大腸桿菌的耐藥譜越來越寬，，防治效果越來越差；此外，藥物防治的成本不斷提高，并造成鴨胴體內(nèi)藥物殘留而影響公共衛(wèi)生 [3] 。因此應(yīng)用藥物治療大腸桿菌病有一定的局限性。從結(jié)果可看出分離株的免疫原性很好，本試驗制備的油乳劑滅活疫苗是針對某些地區(qū)的疫情而研制生產(chǎn)的，因而在使用過程中能在早期很快地形成群體免疫，具有針對性強、免疫期長的特點，且在使用時不存在散毒問題，安全、可靠。
3.4 大腸桿菌是條件性致病菌，普遍存在于鴨群中，當(dāng)環(huán)境改變和抵抗力下降時容易發(fā)生此病。因此建議根據(jù)當(dāng)?shù)亓餍兄赀M行針對性免疫，平時還需要加強環(huán)境管理，此為長期預(yù)防大腸桿菌病的關(guān)鍵。
參考文獻：
[1] 宋立 , 寧易寶 , 張秀英 , 等 . 中國不同地區(qū)禽大腸桿菌血清型分布和耐藥性比較研究 [J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué) ,2005,38(7):1466-1473.
[2]
[3]
[4] 李玲 , 汪銘書 , 程安春 , 等 . 雛鴨致病性大腸桿菌的分離鑒定藥敏試驗及耐藥分析 [J]. 中國獸醫(yī)雜志 ,2007,43(12):34-36.
作者: amypx 時間: 2011-2-24 16:49
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