畜牧人

標(biāo)題: 如何對新城疫開展免疫監(jiān)測 [打印本頁]
作者: lhh1314    時間: 2011-5-28 17:33
標(biāo)題: 如何對新城疫開展免疫監(jiān)測
1 病原
新城疫（ND）是由禽副流感病毒Ⅰ型新城疫病毒（NDV）引起的一種主要侵害雞、火雞、野禽及觀賞鳥類的高度接觸傳染性、致死性疾病。NDV對雞的感染率和致死率均頗高，是最重要的一種家禽傳染病。NDV不易變異，只有一個血清型，屬于副粘病毒科副粘病毒屬的Ⅰ型副粘病毒（PMV-Ⅰ），病毒有囊膜，囊膜有兩種纖突，即血凝素和神經(jīng)氨酸酶，能凝集多種動物的紅細(xì)胞。
盡管已有不少的實(shí)驗(yàn)室方法可用于ND的血清學(xué)診斷，例如，病毒中和試驗(yàn)、ELISA試驗(yàn)、瓊脂雙擴(kuò)散試驗(yàn)、神經(jīng)氨酸酶抑制試驗(yàn)等。但迄今為止，血凝試驗(yàn)（HA）和血凝抑制試驗(yàn)（HI）仍不失為一種快速準(zhǔn)確的傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室手段。
2 實(shí)驗(yàn)材料
2.1 參考血清
實(shí)驗(yàn)中的NDV陽性參考血清可用6~9周齡的SPF雞制造。腿部肌肉注射0.1ml具感染性的低毒力尿囊液，同時滴鼻0.1ml，兩周后重復(fù)一次，再過3周以后采血提取陽性血清。
2.2 抗原
ND-HI抗原是采用經(jīng)適當(dāng)稀釋的具有感染性的尿囊液，在實(shí)際工作中常用0.1%甲醛滅活的病毒液。F株已被指定為NDV的國際參考株，但通常多用LaSota株代替比較方便。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，LaSota血凝抗原HA效價(jià)以＞10log2為佳。目前青島易邦、中檢所和哈獸研均有商品化試劑出售。
2.3 1%紅細(xì)胞液
應(yīng)自SPF或無抗體雞采得。采用翅靜脈或心臟采血后放入有抗凝劑的離心管中，混勻后2000r/min，5~10min，吸去上清和白細(xì)胞膜，再加稀釋液洗滌，如此反復(fù)3~4次，將最后一次離心的紅細(xì)胞泥按1%的稀釋度加入稀釋液。
3 方法
HA和HI試驗(yàn)已推廣β-微量法，在96孔反應(yīng)板上進(jìn)行。目前，常見樣品反應(yīng)量為25、30和50微升，其結(jié)果基本無差異。對所有副粘病毒的各血清型，未免疫或未被感染的禽，其HI效價(jià)通常低于1:8。大多數(shù)禽血清，高于這個水平的非特異性效價(jià)是極少見的。
4 影響結(jié)果的因素
4.1 紅細(xì)胞懸液濃度
來源于不同個體雞的紅細(xì)胞，對抗原的敏感性不盡相同。因此實(shí)驗(yàn)時最好用3~4只未免疫雞。
4.2 抗原的稀釋倍數(shù)
配制抗原時，濃度必須準(zhǔn)確。當(dāng)抗原濃度高時， HI抗體效價(jià)就下降；當(dāng)抗原濃度低時，HI抗體效價(jià)就上升。
4.3 實(shí)驗(yàn)用的稀釋液
稀釋液的pH值對實(shí)驗(yàn)有影響。稀釋液的pH值5.8以下，紅細(xì)胞容易產(chǎn)生自凝現(xiàn)象；pH值在7.8以上凝集圖形易消失，也會造成實(shí)驗(yàn)誤差。而pH值為7.0時，紅細(xì)胞沉降最充分，圖形最清晰，HI效價(jià)也最高，因此實(shí)驗(yàn)時用pH7.0~7.2的稀釋液。目前多用磷酸緩沖液（PBS）。
4.4 實(shí)驗(yàn)時的溫度
實(shí)驗(yàn)時的溫度，從4~37℃，隨著溫度上升，HA與HI滴度提高，但在37℃時，凝集的紅細(xì)胞易洗脫；4℃以下紅細(xì)胞易產(chǎn)生自凝，故操作常用20~22℃。
4.5 實(shí)驗(yàn)的作用時間
一般以30~45min為宜，CP集團(tuán)統(tǒng)一為30min。
4.6 其他
人為因素、操作程序因素、器具的潔凈與否等都會對檢測結(jié)果有影響。不同實(shí)驗(yàn)室間對于同一批次樣品的檢測數(shù)據(jù)不宜做橫向比較，但對同一雞場樣品的檢測結(jié)果的縱向趨勢應(yīng)相似。
5 檢測頻率及采樣數(shù)量
對于健康雞群可每四周檢測一次，對于發(fā)病的雞群，可采集發(fā)病后7~10天的樣品進(jìn)行檢測?？梢园疵總€舍0.6%的比例采樣，但每舍不得少于15份，常規(guī)采樣20~30份即可。
6 檢測時機(jī)
6.1 1d ：檢測母源抗體，考察種代健康情況及確定免疫時間。
6.2 肉雞：35~42日齡，測定出欄前機(jī)體抗體情況。
6.3 種雞/蛋雞：每4周一次。
6.4 免疫試驗(yàn)或疫苗對比試驗(yàn)：每周采血化驗(yàn)。
7 采樣的具體要求
采樣應(yīng)注意樣品數(shù)量與質(zhì)量，既保證時間連續(xù)性，又要兼顧階段連續(xù)性。
7.1 每個雞舍應(yīng)分至少五個點(diǎn)隨機(jī)采樣。采血的量要適當(dāng)，一般在1~1.2ml左右(4/5管)為宜。如果采血量不足，可能不夠完成所有的化驗(yàn)項(xiàng)目。
7.2 采血時采出的血液應(yīng)沿著采血管管壁慢慢注入管內(nèi)，切忌用力過猛起泡造成溶血。
7.3 剛采好的血要避免受冷和振動，應(yīng)在25~37℃環(huán)境中加蓋靜置1~2h，這樣有利于血液凝固和析出血清。靜置后立即送檢，如不能及時送檢。須放入4℃冰箱保存（不要超過24h），切忌冰凍。
7.4 血樣運(yùn)輸時盡可能直立，避免灑漏。
8 采樣方法
8.1 心臟采血（適用于剛出殼到兩周內(nèi)的小雞）
一般用前胸口進(jìn)針采血，具體方法：用左手固定使雞仰臥,胸骨嵴朝上，用手指將嗉囊及其內(nèi)容物壓離局部,暴露出胸前口，將針頭由前胸口順著體中線水平方向刺入,直至穿進(jìn)心臟。若針頭在心臟中，抽拉注射器管芯可將血液吸入,若未見血液吸入針管中，可小心地前后移動注射器和針頭,直到刺入心臟為止。切忌左右亂扎，導(dǎo)致小雞大出血死亡。
8.2 翅靜脈采血
固定雞后,展開翅膀在翅下選一條粗大靜脈，用碘酒和酒精消毒，以手指壓迫靜脈的回心端，使靜脈怒張，然后用注射器刺入血管，發(fā)現(xiàn)血液回流時，用注射器抽取血液。采完后拔出針頭，壓住進(jìn)針處止血，再將血液沿管壁慢慢注入采血管內(nèi)，靜置使血液凝固。
9 如何評價(jià)ND-HI
9.1 正常雞群
9.1.1 母源抗體半衰期為4.5天（HI），出殼后5日齡內(nèi)HI滴度有所升高，然后下降。
9.1.2 商品肉雞母抗≤26，有時可達(dá)29，一般情況下母抗較種代雞低2個滴度。
9.1.3 種雞/蛋雞2個月時可達(dá)26~8 ，甚至更高，多次免疫也不會超過212。
9.1.4 通常一旦建立免疫保護(hù)，HI抗體維持2個月無大變動，抗體波動不會超過2個滴度。
9.1.5 正常情況下，油苗免疫一次可以提升1.5~2個滴度，否則就是免疫失敗，應(yīng)盡快從雞群健康狀況、疫苗質(zhì)量、免疫方法等多方面尋找原因，設(shè)法補(bǔ)救。
9.1.6 免疫雞群血清ND-HI抗體水平與保護(hù)力的關(guān)系
（ND免疫臨界值和產(chǎn)蛋安全免疫臨界值）

ND-HI滴度
雞群接觸到vvNDV后的情況
備注
<4Log2
死亡臨界值。50%以上的死亡率，可達(dá)100%。
免疫抗體
4-7Log2
90%以上的保護(hù)率。
>6Log2
能抵抗呼吸道感染,仍有少數(shù)雞死亡。
8Log2
100%保護(hù)，但產(chǎn)蛋雞群產(chǎn)蛋下降。
9-10Log2
產(chǎn)蛋安全臨界值。
11-13Log2
NDV仍可在雞體內(nèi)復(fù)制。

>13Log2
不再出現(xiàn)NDV復(fù)制（不發(fā)生感染）
強(qiáng)毒感染后的抗體

9.2 發(fā)病雞群
9.2.1 發(fā)病后2w的ND-HI至少比發(fā)病前高2個滴度，個別可能異常高。
9.2.2 肉雞或育雛的種雞/蛋雞發(fā)病后10d，ND-HI可上升5個滴度到210 。
9.2.3 種雞/蛋雞場野毒感染1個月后，個別的滴度可達(dá)214或更高。
9.2.4 生物安全措施良好的雞場往往存在野毒的滾動感染，因此雞場的病程往往持續(xù)數(shù)月之久。如確診的早，可從遠(yuǎn)離發(fā)病舍的（假定）健康雞舍做緊急免疫。
需要認(rèn)識到，常規(guī)血清學(xué)檢測的結(jié)果僅代表雞群的體液抗體（循環(huán)抗體IgG）水平，而ND活苗免疫后產(chǎn)生局部免疫力的分泌型抗體IgA和IgM不能被常規(guī)方法檢測出來。因此用HI結(jié)果來評價(jià)其抗體水平的高低有一定的局限性。另外，HI抗體雖然與病毒的中和抗體呈正相關(guān)，但不能等同。尤其是生產(chǎn)后期，雞群HI滴度有時偏低，但對NDV的實(shí)際抵抗力往往尚高。相反地，有時HI效價(jià)很高，卻仍然會發(fā)生NDV感染。因此，緊密結(jié)合雞群的臨床情況來分析檢測結(jié)果才能幫助我們做出正確判斷并及時發(fā)現(xiàn)和解決生產(chǎn)中的問題。






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