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標題: PRRSV感染豬體內(nèi)多殺性巴氏桿菌的分離與血清型鑒定 [打印本頁]

作者: lzm_001 時間: 2011-7-25 00:54
標題: PRRSV感染豬體內(nèi)多殺性巴氏桿菌的分離與血清型鑒定
陳申秒，李郁，謝玉潔，王桂軍，魏建忠

自2006年入夏以來，我國南方地區(qū)許多豬場發(fā)生了以高熱、呼吸困難、皮膚發(fā)紅為主要特征的流行性疾病—豬“高熱病”，具有高發(fā)病率和高死亡率，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失。為弄清其病因，各地相關(guān)學者對此進行了大量的研究，最后證實豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive andrespiratory syndrome virus，PRRSV)變異株是本次豬高熱病的主要病原。PRRSV感染能嚴重損害機體的免疫器官，造成免疫抑制，從而繼發(fā)其他傳染病。臨床研究發(fā)現(xiàn)，PRRSV單獨感染引起的病理變化多為間質(zhì)性肺炎，然而，發(fā)生高熱病的豬表現(xiàn)的病變情況則較為復(fù)雜和嚴重，表明PRRSV與其他病原體(如豬圓環(huán)病毒2型、副豬嗜血桿菌、多殺性巴氏桿菌等)的繼發(fā)和混合感染是引致豬“高熱病”發(fā)生的原因所在。
安徽省許多地方也同期發(fā)生了疫情較為嚴重的豬“高熱病”，為研究和分析病豬由PRRSV引起的的繼發(fā)或混合感染情況，本試驗應(yīng)用常規(guī)方法和PCR技術(shù)從安徽省多個豬場PRRSV檢測陽性的病料中進行多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multocida，Pm)的分離鑒定，并確定其血清型，從而為安徽省豬“高熱病”的綜合防控提供可靠的理論依據(jù)和技術(shù)支撐。
1材料與方法
1．1試驗材料
1．1．1病料
采集安徽肥西、廬江、肥東、定遠、桐城五個地區(qū)(代號為FX、LJ、FD、DY、TC)豬場病料(肺臟)共計49份，經(jīng)RT．PCR，PRRSV檢測均為陽性。
1．1．2參考菌株
多殺性巴氏桿菌(A型)由本實驗室保存，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌購自中國科學院微生物所。
1．1．3主要試劑
5％胎牛血清肉湯、普通瓊脂、鮮血瓊脂等培養(yǎng)基自制；葡萄糖等細菌微量生化反應(yīng)管以及靛基質(zhì)、硝酸鹽還原試劑盒均購自杭州微生物試劑有限公司；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、TaqDNA聚合酶、MgCl2、dNTP、DL2000DNA Marker等購自上海生工生物工程技術(shù)有限公司。
1．1．4 引物
根據(jù)Townsend等報道合成Pm種與型特異性引物，由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成，見表1。

1．2細菌分離培養(yǎng)
無菌采取病料，接種于5％胎牛血清肉湯，37 ℃振蕩培養(yǎng)l8～24 h后，分別轉(zhuǎn)種到普通瓊脂平板、鮮血瓊脂平板和麥康凱培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h，挑取可疑菌落染色、鏡檢。
1．3生化試驗
將分離菌純化后，接種于上述各種生化培養(yǎng)基中(用前加入5％胎牛血清、0．01％NAD)，37℃培養(yǎng)24～48 h。
1．4細菌DNA模板的制備
將分離純化菌接種到5％胎牛血清肉湯中，37℃、l00 r／min振蕩培養(yǎng)24 h，取5μL菌液直接作為DNA模板。
1．5 Pm種和型的PCR鑒定
反應(yīng)體系：總體積25μL，其中10×PCR Buffer 2．5μL，MgCl2(25 mmol/L)1．5μL，Pml、Pm2、PmAl、PmA2(10 pmoL／L)各1 μL，10 mmol／LdNTPs 0．5μL，ddH20 13μL，DNA模板5μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 S，55℃退火30 S，72℃延伸45 S，共35個循環(huán)；72℃延伸10min。
1．6 PCR產(chǎn)物分析
取5μ L PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠(含0．5μl/mL溴化乙錠)在80 V電壓下電泳40 min，凝膠成像儀上觀察、拍照結(jié)果。
1．7金黃色葡萄球菌抑菌試驗
金黃色葡萄球菌在生長過程中的代謝產(chǎn)物之一是透明質(zhì)酸酶，A型Pm的莢膜成分對其敏感，可產(chǎn)生生長抑制現(xiàn)象。將分離鑒定的Pm以10 mm的間隔劃線接種到鮮血瓊脂培養(yǎng)基，然后以金黃色葡萄球菌垂直劃線，37℃培養(yǎng)24 h，觀察金黃色葡萄球菌接種線周圍Pm是否發(fā)生菌落抑制或消失現(xiàn)象。
2 結(jié)果
2．1細菌分離培養(yǎng)
在49份PRRSV檢測陽性病料中分離到7株疑似Pm。分離菌在鮮血瓊脂培養(yǎng)基上生長良好，初為透明、邊緣整齊的露珠樣菌落，24 h后為灰白色、圓形、微隆起光滑菌落，不溶血；在麥康凱培養(yǎng)基上不生長，普通瓊脂培養(yǎng)基上生長貧瘠。在加5％胎牛血清的肉湯中振蕩培養(yǎng)12 h出現(xiàn)渾濁。單個菌落革蘭氏染色見陰性小桿菌，5％胎牛血清肉湯培養(yǎng)36～48h后菌液染色可看到莢膜，美藍染色可見兩極濃染。7株分離菌均符合多殺性巴氏桿菌生長特性。
2．2生化試驗
7株分離菌生化試驗結(jié)果見表2，均與多殺性巴氏桿菌生化特性相符合。

2．3 Pm種的PCR鑒定
7株分離菌均擴增出大小為457 bp的目的條帶，為多殺性巴氏桿菌。
2．4金黃色葡萄球菌抑菌試驗
在金黃色葡萄球菌接種線周圍，7株P(guān)m周圍均出現(xiàn)明顯生長抑制現(xiàn)象，初步判定為A型Pm。
2．5 Pm型的PCR鑒定
7株P(guān)m均擴增出大小約1 048 bp大小的的目的條帶，屬于A型Pm。
3討論
多殺性巴氏桿菌是豬繁殖與呼吸道綜合征發(fā)病過程中主要繼發(fā)病原菌之一。在49份PRRSV檢測陽性的病料中，分離到細菌l8株，經(jīng)鑒定7株為Pm，2株為副豬嗜血桿菌，3株為鏈球菌，其他細菌6株，其中Pm檢出率為l4．3％(7／49)，與副豬嗜血桿菌4．1％(2／49)、鏈球菌6．1％(3／49)的檢測結(jié)果相比，Pm分離率最高，顯示安徽省豬“高熱病”的發(fā)生與PRRSV引起的繼發(fā)或混合感染Pm密切相關(guān)。因此，在加強豬繁殖與呼吸綜合征、豬瘟等重大疫病免疫的同時，應(yīng)增強豬體抵抗力，減少應(yīng)激，防止細菌繼發(fā)感染。
根據(jù)莢膜抗原的不同，Pm分為A、B、D、E、F共5個血清型，其中A、B和D型已在豬中發(fā)現(xiàn)，從肺炎病例中分離出的最常見血清型是A型。Pijoan從肺臟分離的Pm有87．5％為A型，l2．5％為D型；Robea報道從有肺炎癥狀豬分離的Pm 75％為A型，l3％為D型；李永明等對13株P(guān)m進行莢膜抗原PCR的檢測顯示8株為A型。本次試驗主要是從發(fā)病豬的肺臟進行細菌分離，7株P(guān)m均屬于A型，與國內(nèi)外的研究報道相一致，從而表明A型是當前繼發(fā)感染的多殺性巴氏桿菌的主要血清型。由于Pm的各血清型之間多無交叉免疫反應(yīng)性，因此分析當?shù)亓餍械腜m血清型對于該病的防治及疫苗的研究具有意義。
目前對豬多殺性巴氏桿菌病的微生物學診斷常采用病變組織的涂片染色鏡檢和病原分離、生化反應(yīng)及動物試驗等，若要鑒定莢膜抗原型還需用抗血清甚或單克隆抗體進行血清學試驗。在豬多殺性巴氏桿菌病的快速診斷上，常規(guī)方法存在著一定的局限性。本試驗同時采用了常規(guī)方法和PCR技術(shù)進行Pm分離鑒定，其結(jié)果相一致。由于PCR技術(shù)具有快速、簡便、特異、靈敏的優(yōu)點，并且可以進行莢膜抗原型的特異性檢測，避免了血清學鑒定的不便，因此在Pm及其血清型的鑒定方面，PCR方法具有實際應(yīng)用價值。

作者: 海棠 時間: 2011-7-25 14:10
在我們的臨床診斷中，伴隨藍耳病的主要還是付豬嗜血桿菌和鏈球菌。

作者: zhangxinlq 時間: 2011-7-25 14:49
在臨床上繼發(fā)感染后控制難度比較大

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