簡介:

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)， 俗稱藍耳病，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的一種以母豬流產(chǎn)、早產(chǎn)、產(chǎn)木乃伊胎兒和仔豬呼吸 道癥狀及死亡為特征的傳染病。該病自上世紀出現(xiàn)以來，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴 重的經(jīng)濟損失，被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)列為法定報告的動物疫病，我國將其列 為二類動物疫病。對藍耳病的診斷和預防一直是研究熱點。本研究旨在建立一種 高致病性藍耳病的分子診斷方法，探討研制核酸疫苗的可行性，取得了如下初步 結(jié)果。 1.用Marc-145細胞分離了高致病性藍耳病病毒甘肅株（GS株），對其基因全 序列進行了測定，利用生物信息學軟件對其結(jié)構(gòu)蛋白進行了分析，并對其抗原表 位做了預測。 2.通過序列分析設計合成了3條特異性引物，運用一步法RT-PCR，初步建立 了高致病性藍耳病病毒的分子診斷方法，試驗結(jié)果顯示，該法具有快速、特異和 敏感等特點，可用于臨床樣品的快速檢測。 3.以ORF3和ORF5抗原基因作為核酸疫苗研究的目的基因，用pBudCE4.1載體 構(gòu)建了真核表達載體pBud-GP3和pBud-GP5。用脂質(zhì)體法將pBud-GP3和pBud-GP5 分別轉(zhuǎn)染Marc-145細胞，通過RT-PCR和熒光抗體檢測，目的基因在Marc-145細胞 中獲得了表達；以BALB/c小鼠為動物模型，通過肌肉注射重組質(zhì)粒進行免疫接種， 用間接ELISA檢測抗PRRSV抗體。結(jié)果顯示，pBud-GP3和pBud-GP5能夠有效誘導 機體產(chǎn)生體液免疫,說明ORF3和ORF5抗原基因作為PRRSV核酸疫苗的候選基因 是可行的。 4.選用IFN-γ基因作分子佐劑，構(gòu)建了pBud-IFN-GP3和pBud-IFN-GP5重組質(zhì) 粒。將pBud-IFN-GP3和pBud-IFN-GP5質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Marc-145細胞，通過RT-PCR和熒光 抗體檢測重組質(zhì)粒在體外的表達情況。然后通過肌肉接種免疫BALB/c小鼠，用 ELISA法檢測免疫抗體水平；流式細胞術(shù)檢測T淋巴細胞亞型。結(jié)果顯示： pBud-IFN-GP3和pBud-IFN-GP5重組質(zhì)?？稍鰪娦∈蠹毎庖邞?，IFN-γ發(fā)揮 了免疫佐劑的作用，增強了DNA疫苗的免疫原性，是一種很良好的免疫佐劑。同 時，為了研究CD58分子作為免疫佐劑的可行性，構(gòu)建了pBud-CD-GP3和 pBud-CD-GP5重組質(zhì)粒。將pBud-CD-GP3和pBud-CD-GP5重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染 Marc-145細胞，RT-PCR和熒光抗體檢測結(jié)果表明，CD58分子、GP3和GP5在體外 獲得了表達。為進一步通過動物模型來研究CD58分子的免疫作用奠定了基礎(chǔ)。