發(fā)酵豆粕含有豐富的益生菌及其代謝產(chǎn)物，這些物質(zhì)可改善動(dòng)物腸道微生態(tài)環(huán)境，有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收。與豆粕相比，發(fā)酵豆粕含有豐富的小肽、氨基酸，有利于合成動(dòng)物體內(nèi)自身氨基酸和組織，提高機(jī)體免疫能力，抵御外來(lái)病原體入侵，目前行業(yè)普遍用酸溶蛋白指標(biāo)評(píng)估發(fā)酵豆粕中小肽含量，該指標(biāo)是否能對(duì)發(fā)酵豆粕品質(zhì)進(jìn)行“代言”呢。 一、肽的概念 定義：食品國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《大豆肽粉GBT 22492》2008 版將小肽的定義由<10 KDa 降低到<5 KDa。營(yíng)養(yǎng)學(xué)上關(guān)于小肽的定義稍有差別，但是以分子量范圍來(lái)定義是共識(shí)。 檢測(cè)原理：高分子蛋白質(zhì)在酸性條件下易被沉淀，相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)水解物(酸溶蛋白質(zhì))可溶于酸性溶解液(其中包含肽及游離氨基酸)。樣品經(jīng)酸化后，濾液中的酸溶蛋白質(zhì)含量減去游離氨基酸含量即為肽含量。(GB/T22492-2008大豆肽粉) 二、酸溶蛋白  通常情況下，多肽鏈的水溶性取決于形成多肽的氨基酸之間的肽鍵和氨基酸側(cè)鏈和水分子之間的相互作用力。多肽和蛋白質(zhì)的離子特性和溶解性都取決于組成它的氨基酸的特性。 在受到外界不平衡條件的情況下，如物理?xiàng)l件(高溫，紫外線，劇烈振蕩等)和一些外部環(huán)境化學(xué)成分的變化(強(qiáng)酸，強(qiáng)堿，重金屬鹽等)，會(huì)使得蛋白質(zhì)的側(cè)鏈帶電情況發(fā)生變化，從而導(dǎo)致進(jìn)一步的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。(如圖二)。在高濃度的三氯乙酸溶液里，蛋白分子會(huì)與之相互作用，形成不溶性鹽;同時(shí)強(qiáng)酸作為變性劑，會(huì)使得蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生改變，暴露出較多的疏水基團(tuán)，使之聚沉。  影響酸溶蛋白數(shù)值的三個(gè)因素：肽鏈的長(zhǎng)度、疏水性以及低pH下蛋白片段的帶電情況。這三個(gè)因素共同決定溶解在三氯乙酸溶液中的蛋白含量，肽鏈長(zhǎng)度越長(zhǎng)，疏水性越強(qiáng)，溶解度越小。 因此，發(fā)酵豆粕的酸溶蛋白含量，很大程度上的取決于發(fā)酵使用的菌株特性，芽孢桿菌，乳酸菌，酵母菌，霉菌等，由于不同的菌株代謝產(chǎn)生的酶的種類不同，通過(guò)發(fā)酵產(chǎn)生出來(lái)的大豆蛋白片段長(zhǎng)短，末端氨基酸，蛋白片段的氨基酸種類和帶電性不同，使得在高濃度的三氯乙酸中溶解程度是不一樣的。 實(shí)驗(yàn)證明，15%TCA溶液能溶解的蛋白質(zhì)分子量范圍是在5kDa以下(見(jiàn)下圖三)，最大部分溶解的是2kDa(由約18個(gè)氨基酸組成)左右大小的蛋白質(zhì)分子。  圖三是利用凝膠滲透色譜法(GPC, HPLC的一種)測(cè)定的蛋白質(zhì)分布情況。在凝膠柱中，蛋白質(zhì)大分子通過(guò)由于無(wú)法進(jìn)入凝膠中的孔徑，因此從凝膠間孔徑快速通過(guò)，在色譜圖的前端出現(xiàn);蛋白質(zhì)小分子可通過(guò)凝膠中的孔徑，因此洗脫緩慢，在峰值的后端出現(xiàn)。 我們可以看到圖三中，圖譜的結(jié)果是不同種類的發(fā)酵豆粕產(chǎn)品在三氯乙酸中溶解出來(lái)的上清液中的蛋白質(zhì)分布情況，可以看到蛋白的峰值是從5kDa開始出現(xiàn)的，最高的峰值出現(xiàn)在2-3kDa之間，說(shuō)明了TCA溶解出來(lái)的小肽的分子量都在5kDa以下的。 然而，并不是所有小于5kDa的多肽分子都能被溶解。(見(jiàn)下圖四)  圖四中實(shí)驗(yàn)結(jié)果，同時(shí)測(cè)定的發(fā)酵豆粕樣品整體蛋白分布(紅色峰)和三氯乙酸溶解后上清液的蛋白分布結(jié)果(藍(lán)色峰)?？梢钥吹?，三氯乙酸提取的分子量5kDa以下蛋白質(zhì)部分，而紅色圖譜和藍(lán)色圖譜之間存在一個(gè)灰色的面積區(qū)域是TCA沒(méi)有辦法提取出來(lái)的樣品中的肽含量的部分，即TCA并不能完全溶解出樣品中的所有的肽，只能溶解出其中的一小部分。因此，利用酸溶蛋白溶解出來(lái)的蛋白含量來(lái)判定樣品的小肽含量，結(jié)果是片面的，不準(zhǔn)確的。 這是因?yàn)樗崛艿鞍椎闹荡笮∪Q與多肽片段的大小，以及構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸和多肽的疏水性，因此，三氯乙酸沉淀的并不都是大分子蛋白質(zhì);同時(shí)一些非蛋白氮和游離氨基酸也會(huì)被溶解在上清液中一起被檢測(cè)出來(lái)。另外，由于三氯乙酸本身的刺激性氣味，強(qiáng)酸，強(qiáng)腐蝕性，我們都不建議使用三氯乙酸沉淀法去判斷小肽含量。 目前，現(xiàn)有的小肽檢測(cè)方法——酸溶蛋白顯然并不能準(zhǔn)確的反應(yīng)發(fā)酵豆粕中肽的含量;最準(zhǔn)確的可以測(cè)定出小肽含量和小肽分布情況的方法是利用高效液相色譜去測(cè)定，但由于需要專業(yè)的技術(shù)人員和設(shè)備，檢測(cè)成本相對(duì)較高，一般不作為出廠檢測(cè)的推薦方法。韓國(guó)希杰集團(tuán)研究所在發(fā)酵豆粕-速益肽產(chǎn)品的長(zhǎng)期研究過(guò)程中，韓國(guó)希杰集團(tuán)研究所在發(fā)酵豆粕-速益肽產(chǎn)品的長(zhǎng)期研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)發(fā)酵豆粕的水溶性蛋白(NSI值)含量和高效液相法(GPC<30 kDa的肽含量)測(cè)定肽含量值存在高度正相關(guān)關(guān)系。在后續(xù)推文中會(huì)詳細(xì)闡述，敬請(qǐng)關(guān)注! （文章來(lái)源：CJ希杰BestProtein） |
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