玉米赤霉烯酮對斷奶小母豬生產(chǎn)性能、血清抗氧化功能和免疫功能的影響

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玉米赤霉烯酮對斷奶小母豬生產(chǎn)性能、血清抗氧化功能和免疫功能的影響

楊立杰 王淑靜 楊維仁 黃麗波 劉法孝 姜淑貞 楊在賓

　　摘要：為了研究不同水平玉米赤霉烯酮 (zearalenone, ZEA) 污染飼糧對斷奶小母豬生產(chǎn)性能、血清抗氧化功能、血清抗體水平及外周血淋巴細(xì)胞增殖率的影響。將40頭健康三元雜交 (杜×長×大) 斷奶小母豬按日齡[ (35±1) 日齡]和平均體重[ (14.01±0.86) kg]分為4組, 對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧 (ZEA水平的測定值為0 mg/kg) , 試驗組在基礎(chǔ)飼糧中分別添加0.5、1.0及1.5 mg/kg ZEA[ZEA水平的測定值分別為 (0.52±0.07) mg/kg、 (1.04±0.03) mg/kg和 (1.51±0.13) mg/kg]。預(yù)試期10 d, 正試期35 d。結(jié)果表明:飼糧ZEA對斷奶小母豬平均日采食量、平均日增重和料重比沒有顯著影響(P>0.05) 。與對照組相比, ZEA顯著降低了血清谷胱甘肽過氧化物酶 (GSH-Px, 0.5、1.0和1.5 mg/kg ZEA) 活性、豬瘟 (1.0和1.5 mg/kg ZEA) 和偽狂犬病病毒抗體水平 (1.5 mg/kg ZEA) 以及外周血淋巴細(xì)胞增殖率 (1.0和1.5 mg/kg ZEA) (P<0.05) , 而顯著升高了血清丙二醛 (MDA, 0.5、1.0和1.5 mg/kgZEA)含量 (P<0.05) 。隨著飼糧中ZEA水平的升高, 斷奶小母豬的料重比呈一次線性降低趨勢 (P=0.075) ,血清GSH-Px、超氧化物歧化酶 (SOD) 活性, 血清病毒 (豬瘟、偽狂犬病和高致病性豬藍(lán)耳病病毒)抗體水平和外周血淋巴細(xì)胞增殖率均呈一次線性降低 (P<0.05) , 而血清MDA含量則呈一次線性升高 (P<0.05) 。由此可見, 飼糧中0.5 mg/kg的ZEA足以誘導(dǎo)小母豬的氧化應(yīng)激反應(yīng), 1.0 mg/kg的ZEA能夠顯著降低斷奶小母豬的特異性體液免疫和細(xì)胞免疫功能。

　　關(guān)鍵詞：玉米赤霉烯酮; 斷奶小母豬; 生產(chǎn)性能; 谷胱甘肽過氧化物酶; 丙二醛; 抗體水平; 淋巴細(xì)胞增殖率;

　　玉米赤霉烯酮(zearalenone, ZEA) 又名F&#8259;2毒素, 是由鐮刀菌產(chǎn)生的一種2,4-二羥基苯甲酸內(nèi)酯類化合物[1]。調(diào)查結(jié)果顯示, ZEA是中國飼料原料及配合飼料檢出水平最高的霉菌毒素之一[2]。飼料中較高水平的ZEA能夠引起母豬不孕、流產(chǎn)和假發(fā)情等繁殖障礙[3], 長期飼喂低水平ZEA飼料,造成母豬發(fā)情周期延長、產(chǎn)仔數(shù)減少、仔豬體弱、死胎和不育[4], ZEA已經(jīng)成為養(yǎng)豬業(yè)的第二大殺手[5-6]。國內(nèi)外有關(guān)ZEA的研究多集中在生殖系統(tǒng)[7], 而ZEA對斷奶小母豬血清抗氧化功能、血清抗體水平及外周血淋巴細(xì)胞增殖率的影響尚未見系統(tǒng)報道。本試驗旨在研究飼糧中不同水平ZEA (0.5~1.5 mg/kg) 對斷奶小母豬生長性能, 血清抗氧化功能, 血清豬瘟、偽狂犬病和高致病性豬藍(lán)耳病病毒抗體水平及外周血淋巴細(xì)胞增殖率的影響, 以期揭示ZEA的氧化應(yīng)激和免疫毒性,為ZEA的毒性機(jī)制及養(yǎng)豬生產(chǎn)中相關(guān)疾病的防治和繁殖障礙提供理論依據(jù)和思路。

　　1 材料與方法

　　1.1 試驗材料

　　ZEA購自于以色列Fermentek公司, 色譜純, 純度保證值為98%。

　　1.2 試驗設(shè)計與飼養(yǎng)管理

　　選擇25~28日齡健康的三元雜交 (杜×長×大) 斷奶雌性小母豬40頭, 在產(chǎn)床上繼續(xù)飼養(yǎng)10 d,然后轉(zhuǎn)入試驗籠, 單籠 (0.48 m) 飼養(yǎng), 根據(jù)日齡[ (35±1) 日齡]和平均體重[ (14.01±0.86) kg]分成4組,每組10頭, 組間初始體重差異不顯著 (P>0.05) 。斷奶小母豬基礎(chǔ)飼糧參考NRC (2012) 營養(yǎng)需要配制, 其組成及營養(yǎng)水平見表1。對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧, 試驗組在基礎(chǔ)飼糧中分別添加0.5、1.0和1.5 mg/kg ZEA, ZEA測定值分別為(0.52±0.07) mg/kg、 (1.04±0.03) mg/kg和1.51±0.13 mg/kg。預(yù)試期10 d, 正試期35 d。

　　單體籠使用塑料漏縫地板, 安裝有乳頭飲水器和料槽, 小母豬自由采食和飲水。試驗開始前對豬舍進(jìn)行全面清掃、消毒, 試驗期間每周進(jìn)行1次豬舍消毒。舍內(nèi)安裝紅外保溫?zé)? 第1周維持試驗籠內(nèi)溫度在30℃左右, 第2周將豬舍內(nèi)環(huán)境溫度維持在26~28℃。豬舍相對濕度為65%。預(yù)試期10 d, 正試期35 d, 自由采食飲水。小母豬管理和免疫按常規(guī)進(jìn)行。其中, 豬瘟病毒疫苗于小母豬出生后第21天肌肉注射;偽狂犬病病毒疫苗于小母豬出生后72 h內(nèi)滴鼻, 第28天進(jìn)行2次免疫;高致病性豬藍(lán)耳病病毒疫苗于小母豬出生第14天進(jìn)行肌肉注射免疫。試驗結(jié)束后小母豬全部屠宰。動物試驗于2016年4—6月在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧科技園進(jìn)行。

　　1.3 ZEA污染飼糧的配制

　　將色譜純 (純度為98%) 的晶體粉末狀ZEA由乙酸乙酯溶解制成溶液, 再將含有ZEA的乙酸乙酯溶液噴灑到一定量的滑石粉載體上, 并放置過夜使乙酸乙酯揮發(fā), 制成1 000 mg/kg的ZEA預(yù)混劑,然后用不含毒素的玉米粉進(jìn)一步將1 000 mg/kg的ZEA預(yù)混劑稀釋成10 mg/kg的ZEA預(yù)混劑, 最后按照各組飼糧中ZEA的設(shè)計水平, 用ZEA預(yù)混劑替代配方中的玉米和載體配制成試驗飼糧。試驗所需飼糧于試驗正式開始前1周一次性配合完成, 裝袋后儲存于干燥通風(fēng)處。在試驗前和試驗結(jié)束分別取樣后, 立即進(jìn)行飼糧中養(yǎng)分含量和毒素水平檢測。取樣方法按照《飼料采樣方法》 (GB/T 14699.1—1993) 。

　　1.4 飼糧常規(guī)養(yǎng)分和毒素的測定

　　飼糧常規(guī)養(yǎng)分測定參考AOAC(2012) 的方法進(jìn)行。粗蛋白質(zhì)含量用凱氏定氮法測定;消化能用HR-15氧彈式熱量計測定;鈣含量根據(jù)高錳酸鉀滴定法測定;總磷含量根據(jù)鉬黃比色法測定;氨基酸含量用日立835-50氨基酸自動分析儀進(jìn)行測定。

　　飼糧毒素水平測定:飼糧中ZEA、嘔吐毒素、黃曲霉毒素和煙曲霉毒素水平委托青島出入境檢測檢疫局測定。采用免疫親和柱層析凈化, 以液相色譜法熒光檢測器測定ZEA和黃曲霉毒素的水平, 外標(biāo)法定量。采用免疫親和層析凈化高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法, 以液相色譜結(jié)合紫外檢測器測定煙曲霉毒素和嘔吐毒素的水平, 外標(biāo)法定量。黃曲霉毒素、ZEA、嘔吐毒素和煙曲霉毒素的最低檢測限分別為1.0μg/kg、0.1 mg/kg、0.1 mg/kg和0.25 mg/kg。各組飼糧ZEA的實際測定值分別為0 mg/kg (0、0) mg/kg, (0.52±0.07) mg/kg (0.59、0.45 mg/kg) , (1.04±0.03) mg/kg (1.01、1.07 mg/kg) 和 (1.51±0.13) mg/kg (1.38、1.64 mg/kg) (括號內(nèi)為2次的測定值) , 2次均未檢測到其他毒素或者毒素水平低于檢測限水平。

　　1.5 樣品采集與指標(biāo)測定

　　1.5.1 生長性能測定

　　每天記錄小母豬采食量與剩料量, 試驗前后對小母豬進(jìn)行稱重, 計算平均日增重 (ADG) 、平均日采食量 (ADFI) 和料重比 (F/G) 。

　　1.5.2 血樣的采集、處理與測定

　　正試期第35天晨飼前, 對小母豬進(jìn)行前腔和耳緣靜脈空腹采血。使用真空抗凝管 (內(nèi)加K2EDTA) 采集耳緣靜脈全血15 mL, 采血后立即顛倒混勻8次, 血液標(biāo)本于0℃中暫存, 立即帶回實驗室用于測定外周血淋巴細(xì)胞增殖率。另用真空促凝管采集前腔靜脈血30 mL, 于3 000 r/min下離心10 min分離血清, 用以測定抗體水平、抗氧化功能。

　　1.5.3 血清抗氧化功能分析

　　血清中谷胱甘肽過氧化物酶(GSH&#8259;Px) 、超氧化物歧化酶 (SOD) 活性、丙二醛 (MDA) 含量均采用752型紫外可見分光光度計測定,具體步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行測定。GSH&#8259;Px試劑盒 (A005)、MDA試劑盒 (A003) 和SOD試劑盒 (A001&#8259;1) 購于南京建成生物工程研究所。

　　1.5.4 血清抗體水平分析

　　按照豬瘟、偽狂犬病和高致病性豬藍(lán)耳病病毒抗體酶聯(lián)免疫吸附測定 (ELISA) 試劑盒 (CIVTEST SUISHC/PPC, 法國LSI公司) 說明書步驟進(jìn)行操作, ELISA儀 (FAME 24/20, 瑞士HAMILTON公司) 測450 nm波長下吸光度 (OD) 值, 與ELISA試劑盒中標(biāo)準(zhǔn)品及其對應(yīng)OD值進(jìn)行比對, 進(jìn)行抗體水平分析。

　　1.5.5 外周血淋巴細(xì)胞增殖率的測定

　　血液預(yù)處理:將全血與D&#8259;Hanks溶液按1∶1混合, 加入到淋巴細(xì)胞分離液中于2000 r/min離心30 min。取中間白細(xì)胞部分, 用紅細(xì)胞裂解液裂解其中紅細(xì)胞后, 用RPMI-1640 (美國Hyclone公司) 清洗3次, 每次清洗后離心5 min (2 000 r/min) , 用臺盼藍(lán)染色計數(shù)活細(xì)胞數(shù) (應(yīng)在95%以上) , 然后將脾淋巴細(xì)胞懸浮于RPMI-1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度到2×10個/mL。

　　淋巴細(xì)胞增殖率測定:將上述細(xì)胞懸液分加于96孔培養(yǎng)板中, 每孔190μL, 同時加10μL伴刀豆凝集素A(ConA) 。將培養(yǎng)板置于5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi), 37℃培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)結(jié)束前4 h, 每孔加入100μL 3- (4, 5-二甲基噻唑-2) -2, 5-二苯基四氮唑溴鹽 (MTT) , 繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后, 每孔吸出100μL上清液, 加入100μL二甲基亞砜 (DSMO) 溶解紫色結(jié)晶產(chǎn)物, 用酶聯(lián)免疫檢測儀在570 mn波長下測定OD值。以對照組吸光度值為1, 將試驗組與對照組進(jìn)行比較, 分析得出各試驗組細(xì)胞數(shù)量相對于對照組的百分比, 即為淋巴細(xì)胞增殖率。

　　1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

　　數(shù)據(jù)分析采用SAS 9.2統(tǒng)計軟件, 各組間差異采用單因素方差(one&#8259;way ANOVA) 分析, 采用正交多項式比較法對不同ZEA水平梯度的處理效應(yīng)進(jìn)行一次線性回歸分析, 用Duncan氏多組極差檢驗法進(jìn)行多重比較, 顯著性水平P<0.05。

　　2 結(jié)果與分析

　　2.1 ZEA對斷奶小母豬生長性能的影響

　　由表2可知, ZEA對斷奶小母豬的平均日增重、平均日采食量和料重比均沒有顯著影響 (P>0.05)。但是, 隨著飼糧ZEA水平的升高, 飼糧料重比呈一次線性降低的趨勢 (P=0.075) 。

　　2.2 ZEA對斷奶小母豬血清抗氧化功能的影響

　　由表3可知, 與對照組相比, 0.5、1.0和1.5 mg/kgZEA組的血清GSH&#8259;Px活性均顯著降低(P<0.05) ,而血清MDA含量則顯著升高 (P<0.05) 。隨著飼糧ZEA水平的增加, 血清GSH&#8259;Px和SOD活性呈一次線性降低(P<0.05) , 血清MDA含量則呈一次線性升高 (P<0.05) 。

　　2.3 ZEA對斷奶小母豬血清抗體水平的影響

　　由表4可知, 1.5 mg/kgZEA組的血清豬瘟、偽狂犬病病毒抗體水平均顯著低于對照組 (P<0.05) , 1.0 mg/kg ZEA組的血清豬瘟病毒抗體水平顯著低于對照組 (P<0.05), 各組間的血清高致病性豬藍(lán)耳病病毒抗體水平差異不顯著 (P>0.05) 。隨著飼糧ZEA水平的增加, 斷奶小母豬的血清豬瘟、偽狂犬病和高致病性豬藍(lán)耳病病毒抗體水平均呈一次線性降低 (P<0.05) 。

　　2.4 ZEA對斷奶小母豬外周血淋巴細(xì)胞增殖率的影響

　　由圖1可知, 與對照組相比, 1.0和1.5 mg/kgZEA組的外周血淋巴細(xì)胞增殖率顯著降低 (P<0.05) ,而0.5 mg/kg組無顯著變化 (P>0.05) 。隨著飼糧ZEA水平的增加, 斷奶小母豬的外周血淋巴細(xì)胞增殖率呈一次線性降低 (P<0.05) 。

　　3 討論

　　近期有關(guān)ZEA在動物飼糧中的研究, 多是采用已知ZEA水平的天然污染飼糧為試驗材料[1,8-10]。為了避免天然污染飼糧中, 其他毒素對ZEA毒性的機(jī)制研究產(chǎn)生的干擾, 本研究選擇高純度ZEA, 在本實驗室前期研究結(jié)果[1,3,9-10]基礎(chǔ)上, 繼續(xù)探索較低水平ZEA (0.5~1.5 mg/kg) 對斷奶小母豬的氧化應(yīng)激和免疫毒性。

　　3.1 ZEA對斷奶小母豬生長性能的影響

　　ZEA在斷奶小母豬平均日采食量、平均日增重及料重比方面的研究結(jié)論并不一致。有研究報道, 斷奶仔豬飼糧中添加3 mg/kg的ZEA沒有顯著影響仔豬平均日采食量、平均日增重和料重比[11]。飼糧添加1~3 mg/kg的ZEA對仔豬的平均日增重和料重比也沒有顯著改變[12]。然而Powell&#8259;Jones等[13]研究發(fā)現(xiàn), ZEA具有潛在促生長作用, 而在結(jié)論中, 并未對ZEA具體水平進(jìn)行分析。本研究條件下, 飼糧中添加0.5~1.5 mg/kg ZEA對小母豬的平均日采食量、平均日增重和料重比均沒有顯著影響, 但值得一提的是, 斷奶小母豬的料重比隨著ZEA水平的增加呈現(xiàn)出線性降低趨勢 (P=0.075) , 表明低水平 (0.5~1.5 mg/kg) ZEA具有潛在的促生長作用。另有報道顯示, 隨著飼糧中ZEA水平 (3.0~9.0 mg/kg) 的增加, 母豬 (初始體重為64 kg) 的采食量、平均日增重和飼糧報酬均呈現(xiàn)下降趨勢[14]。綜上所述, 飼糧中不同水平的ZEA在生豬不同生長階段具有不同的作用效果, 有關(guān)ZEA水平與動物生長性能之間的相關(guān)性及其作用機(jī)理的研究, 尚需進(jìn)一步研究證實。

　　3.2 ZEA對斷奶小母豬血清抗氧化功能的影響

　　自由基反應(yīng)對動物機(jī)體的防御機(jī)制是必要的, 正常動物體內(nèi)自由基的產(chǎn)生與清除處于動態(tài)平衡。研究表明, ZEA能夠刺激動物機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激[15-16], 使機(jī)體氧化能力超過抗氧化能力, 進(jìn)而增加動物體內(nèi)氧自由基的數(shù)量, 最終導(dǎo)致生物膜脂過氧化[17-18]。飼糧中添加2.0和3.2 mg/kg ZEA使仔豬血清中GSH&#8259;Px的活性顯著低于不添加ZEA組[19]。血清MDA含量作為反映細(xì)胞損傷的生物標(biāo)記物, 在本研究條件下, 對照組血清MDA含量均顯著低于ZEA組, 且隨著ZEA水平的增加呈一次線性增加;對照組血清GSH&#8259;Px活性顯著高于ZEA組, 隨著ZEA水平增加呈一次線性下降。我國《飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定仔豬飼糧中ZEA最高限定水平為0.5 mg/kg (GB 13078.2—2006) , 歐盟關(guān)于仔豬飼糧中ZEA的最高限定水平為0.1mg/kg[20]。值得強(qiáng)調(diào)的是, 本研究條件下, 飼糧中添加0.5 mg/kg ZEA足以能夠引起仔豬氧化應(yīng)激反應(yīng), 使機(jī)體血清抗氧化功能顯著降低, 給我國《飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》仔豬飼糧中ZEA限量標(biāo)準(zhǔn)提供了理論依據(jù)。盡管研究者們對ZEA降低血清抗氧化功能的觀點普遍認(rèn)可[21-23], 但尚未見低水平ZEA對動物機(jī)體啟動過氧化機(jī)制的研究報道, 其分子機(jī)制有待畜牧工作者進(jìn)行更深層次的探究。

　　3.3 ZEA對斷奶小母豬血清抗體水平的影響

　　豬瘟、偽狂犬病和高致病性豬藍(lán)耳病均是對仔豬健康有巨大威脅的傳染病。多數(shù)情況下, 免疫接種能夠起到相對理想的效果, 但是多年來免疫失敗或豬群體免疫反應(yīng)低下的現(xiàn)象也是屢見不鮮, 成為疫情爆發(fā)的重大安全隱患。報道顯示, 正常豬瘟免疫18 d后, 2.0和3.2 mg/kg ZEA組仔豬體內(nèi)豬瘟病毒抗體水平顯著低于對照組[24]。本研究結(jié)果顯示, 飼糧中添加1.0和1.5 mg/kg ZEA能夠顯著降低豬瘟病毒抗體水平, 且1.5 mg/kg ZEA組偽狂犬病病毒抗體水平顯著低于對照組;豬瘟、偽狂犬病和高致病性豬藍(lán)耳病病毒抗體水平隨著飼糧中ZEA水平的增加均呈一次線性下降, 提示ZEA抑制了病毒抗體的產(chǎn)生, 對斷奶小母豬體液免疫功能產(chǎn)生了負(fù)面影響。單一毒素ZEA啟動機(jī)體病毒抗體水平降低的最低水平尚未見報道, 因此飼糧中ZEA水平與斷奶小母豬體內(nèi)病毒抗體水平變化的相關(guān)性探索及其機(jī)理, 將是本課題組接下來的重要研究內(nèi)容之一。

　　3.4 ZEA對斷奶小母豬外周血淋巴細(xì)胞增殖率的影響

　　淋巴細(xì)胞的增殖能力是反映細(xì)胞免疫功能的一項重要指標(biāo)。Lioi等[25]研究發(fā)現(xiàn), ZEA能夠抑制牛淋巴細(xì)胞的增殖;另有研究顯示, ZEA能夠極顯著抑制離體小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的增殖[26-27]。眾多研究表明, 離體條件下ZEA可使淋巴細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)失調(diào)而發(fā)揮免疫毒性作用, 對小鼠外周血淋巴細(xì)胞產(chǎn)生直接毒害作用[28-30]。前人關(guān)于ZEA對淋巴細(xì)胞增殖率的研究結(jié)論, 大多是在離體條件下得出的, 而采食ZEA飼糧對斷奶小母豬外周血淋巴細(xì)胞增殖率的研究卻鮮有報道。本研究結(jié)果表明, 飼糧中添加1.0 mg/kg的ZEA能夠使小母豬外周血淋巴細(xì)胞增殖率顯著降低,提示飼糧中1.0 mg/kg ZEA足以誘導(dǎo)小母豬的細(xì)胞免疫。本課題組將通過細(xì)胞和分子生物學(xué)手段,進(jìn)一步探索飼糧中ZEA水平與斷奶小母豬細(xì)胞免疫和體液免疫的相關(guān)性。

　　4 結(jié)論

　　①飼糧中0.5~1.5mg/kg ZEA對斷奶小母豬生長性能沒有顯著影響, 但小母豬料重比隨飼糧ZEA水平的升高呈一次線性降低。

　　②飼糧0.5 mg/kgZEA足以誘導(dǎo)斷奶小母豬血清的氧化應(yīng)激反應(yīng), 血清GSH&#8259;Px活性顯著降低, 血清MDA含量則顯著升高, 且二者隨飼糧ZEA水平升高呈一次線性變化。

　　③飼糧1.0 mg/kgZEA足以誘導(dǎo)斷奶小母豬的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng), 血清病毒 (豬瘟、偽狂犬病和高致病性豬藍(lán)耳病病毒) 抗體水平和外周血淋巴細(xì)胞增殖率隨飼糧ZEA水平增加均呈一次線性降低。

　　本文來源：  母豬母儀天下之豬