您一定沒(méi)聽(tīng)說(shuō)過(guò)非洲豬瘟和恩諾沙星之間的關(guān)系

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翻譯 | 臧富玉、周磊、朱大俊、郭濤           

校對(duì) | 郭濤

喹喏酮類藥物對(duì)非洲豬瘟的體外抗病毒

活性研究

摘要

非洲豬瘟是一種病毒性疾病，目前尚無(wú)有效的疫苗和治療方法。通過(guò)對(duì)30種喹喏酮類藥物對(duì)非洲豬瘟病毒（ASFV）感染的抗病毒作用體外篩選，發(fā)現(xiàn)從感染早期開(kāi)始，暴露于其中6種喹喏酮類藥物（恩諾沙星，格列沙星，巴洛沙星，妥舒沙星，加替沙星，加雷沙星）或他們的一些組合時(shí)，ASFV感染的Vero細(xì)胞的細(xì)胞病變效應(yīng)嚴(yán)重降低。此外，經(jīng)過(guò)藥物7天的處理后，PCR檢測(cè)不到ASFV基因組，而且細(xì)胞培養(yǎng)上清液無(wú)法感染新的細(xì)胞。脈沖式凝膠電泳（PFGE）分析顯示，暴露于這些喹喏酮類藥物的細(xì)胞中，基因組碎片無(wú)法識(shí)別，病毒DNA復(fù)制減少，早期感染觀察到病毒蛋白合成模式發(fā)生改變。總體結(jié)果表明，細(xì)菌拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑（喹喏酮類藥物）可能通過(guò)某種靶向作用ASFV-拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ來(lái)干擾ASFV的復(fù)制循環(huán)，為抗病毒治療打開(kāi)了新的窗口。

1、引言

非洲豬瘟（ASF）是養(yǎng)豬業(yè)中最具威脅的疾病之一。它在大多數(shù)撒哈拉以南非洲國(guó)家流行，2007年經(jīng)格魯尼亞重新傳入歐洲大陸。從那時(shí)起，它開(kāi)始蔓延到周邊國(guó)家，極大地改變了歐洲的非洲豬瘟形勢(shì)。除了受鄰近國(guó)家的影響外，歐盟面臨著引入非洲豬瘟的嚴(yán)重危險(xiǎn)。由于缺乏協(xié)調(diào)的控制計(jì)劃，缺少生物安全措施，以及傳統(tǒng)上使用泔水喂養(yǎng)，俄羅斯聯(lián)邦及其鄰近地區(qū)對(duì)ASF的控制一直受到阻礙。在這種情況下，東歐的ASF的情況會(huì)讓ASF進(jìn)入歐盟的風(fēng)險(xiǎn)不斷增加，尤其是那些難以控制的路線，如野豬的活動(dòng)、動(dòng)物和動(dòng)物產(chǎn)品、受污染的車(chē)輛或其他污染物的非法轉(zhuǎn)運(yùn)。盡管人們努力研發(fā)疫苗，但目前還沒(méi)有突破，對(duì)該病的控制依賴于早期診斷和實(shí)施包括撲殺在內(nèi)的嚴(yán)格生物安全措施，同時(shí)這些措施對(duì)受影響的國(guó)家造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)危害。非洲豬瘟其病原是非洲豬瘟病毒（ASFV），一種大型DNA病毒，是非洲豬瘟科的唯一成員。ASFV編碼一種拓?fù)洚悩?gòu)Ⅱ型酶，這是哺乳動(dòng)物感染病毒的一個(gè)獨(dú)特特征。系統(tǒng)發(fā)育學(xué)研究表明，ASFV-拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ不與宿主細(xì)胞Ⅱ型拓?fù)洚悩?gòu)酶發(fā)生分支，與細(xì)菌DNA促旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ具有約25%的整體同源性，這增加了使用抗菌拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑（如喹喏酮類）干擾ASFV復(fù)制的可能性。

喹喏酮類化合物通過(guò)捕獲DNA上的DNA促旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ，促進(jìn)藥物-酶-DNA裂解復(fù)合物的形成，從而表現(xiàn)出強(qiáng)大的抗菌活性。藥物-酶-DNA裂解復(fù)合物誘導(dǎo)DNA復(fù)制的破壞，并觸發(fā)細(xì)胞死亡機(jī)制（如氧化應(yīng)激和基因組破碎）。DNA促旋酶負(fù)責(zé)在復(fù)制叉前減輕扭轉(zhuǎn)應(yīng)力，拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ則顯示了對(duì)基因組拆開(kāi)的有效能力。

最近的研究表明，氟喹諾酮分子結(jié)構(gòu)的化學(xué)修飾導(dǎo)致了它們對(duì)RNA和DNA病毒新的“非經(jīng)典”抗病毒特性?？紤]到ASFV編碼一種拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ，我們旨在通過(guò)Ba71V分離物感染Vero細(xì)胞培養(yǎng)，分析這些抗生素對(duì)ASFV-DNA復(fù)制和病毒蛋白合成的潛在抑制活性。鑒于目前還沒(méi)有針對(duì)ASF的疫苗和治療方法，發(fā)現(xiàn)新的抗病毒藥物并將其應(yīng)用于疫情中心附近農(nóng)場(chǎng)的豬只，從而在疫情周?chē)⒁粋€(gè)安全圈，這對(duì)于控制感染的傳播和給當(dāng)局實(shí)施應(yīng)對(duì)措施的時(shí)間可能非常有用。

2、材料與方法

2.1  細(xì)胞培養(yǎng)和病毒傳播

Vero E6細(xì)胞來(lái)自ECACC，保存在DMEM中，添加10%熱滅活犢牛血清、2m ML谷氨酰胺和非必需氨基酸（均來(lái)自Gibco公司），細(xì)胞保存在37℃、5%二氧化碳濃度、>90%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。如前所述，ASFV-Ba71V分離物通過(guò)在Vero細(xì)胞上的菌斑試驗(yàn)進(jìn)行繁殖和滴定。

2.2  病毒感染和藥物治療

采用DMEM培養(yǎng)基將亞融合Vero細(xì)胞在6孔板上培養(yǎng)至每cm2約5萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，并以0.1倍（MOI=0.1）的倍數(shù)感染ASFV-Ba71V。病毒吸附1小時(shí)后，取出接種物，用DMEM洗滌細(xì)胞2次。感染4小時(shí)后，ASFV感染的Vero細(xì)胞從第一代至第四代暴露于30個(gè)喹喏酮類藥物，分別是：萘啶酸，氟甲喹，環(huán)丙沙星，依諾沙星，氟羅沙星，洛美沙星，那氟沙星，氧氟沙星，諾氟沙星，巴洛沙星，格雷沙星，左氧氟沙星，帕珠沙星，司帕沙星，托氟沙星，貝西沙星，克林沙星，加雷沙星，吉米沙星，莫西沙星，加替沙星，西他沙星，達(dá)氟沙星，二氟沙星，恩諾沙星，馬波沙星，奧比沙星，普多沙星，沙氟沙星和新生霉素，分別是以下濃度500、400、300、200、100、75、50、25、10、5和1 ug/ml。所有藥物均購(gòu)自Sigma公司和安徽五礦開(kāi)發(fā)有限公司，以1 mg/ml (0.1 M PBS/NaOH)的原液配制。培養(yǎng)7天，每24小時(shí)更換含抗生素培養(yǎng)基。每天用藥物原液稀釋(10 mg/ml, 0.1 M PBS/NaOH稀釋)，制備工作溶液。除了感染細(xì)胞外，還包括使用暴露于最高濃度氫氧化鈉稀釋劑的感染細(xì)胞的作為對(duì)照。預(yù)防試驗(yàn)在ASFV感染前2小時(shí)添加抗生素，7天內(nèi)每24小時(shí)補(bǔ)充一次。

2.3 PCR檢測(cè)非洲豬瘟病毒（ASFV）DNA

使用通過(guò)本課題組前期所述的A238L編碼區(qū)的引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)病毒DNA (Gilet al., 2003)，病毒DNA從感染的Vero細(xì)胞中提取，該Vero細(xì)胞未經(jīng)過(guò)氟喹諾酮類藥物商業(yè)試劑盒治療處理，提取步驟完成后，將1 ul DNA轉(zhuǎn)移到含有2.5 ul Taq緩沖液(10×)、1 ul MgCl2 (25 uM)、0.5 ul dNTP’s (10 uM)、15.3 ul ddH2O、0.2 ul Taq、0.25 ul各引物(100 uM)、正向(5’- GGCCGTACTTCAAATGTGCT-3’)和反向(5’- CCAGTCCCAAGCAGTAAAGC -3’)的PCR 混合液中，共25 ul。PCR反應(yīng)如下：94℃2分鐘，95℃變性30秒，42℃退火30秒，72℃擴(kuò)展1分鐘，最后72℃擴(kuò)展10分鐘。以2%的溴化乙錠瓊脂糖凝膠為載體，在紫外光下觀察擴(kuò)增產(chǎn)物(預(yù)測(cè)720bp)。7天后，用培養(yǎng)上清液感染新的Vero細(xì)胞培養(yǎng)，重復(fù)上述步驟。

2.4  脈沖式凝膠電泳（PFGE）

Ba71V分離物分別以MOI為0.1、1和5感染Vero細(xì)胞，并在感染16小時(shí)后收集，經(jīng)胰蛋白酶處理之后，將4×105個(gè)細(xì)胞包埋在低熔點(diǎn)瓊脂糖塞子中，并且在固定之后，將來(lái)自每個(gè)實(shí)驗(yàn)組的塞子轉(zhuǎn)移到含有2ml裂解緩沖液（125 mM EDTA, pH 8.0,1.2% SDS和蛋白酶K）的試管中50℃24小時(shí)，然后在24小時(shí)內(nèi)用Tris-EDTA緩沖液(10mM Tris-HCl, pH 7.6和50mM EDTA, pH 8.0)對(duì)塞子進(jìn)行清洗，將總DNA包埋在塞子中，在1%瓊脂糖凝膠、0.5 ×Tris-Borate-EDTA緩沖液(45 mM Tris-HCl, 45 mM 硼酸, 1mM EDTA)中凝膠電泳。分離在CHEF DR II設(shè)備上進(jìn)行，120度場(chǎng)角，8-30 s開(kāi)關(guān)時(shí)間，6 V/cm, 14 ℃ 24小時(shí)，緩沖溫度是用冰浴進(jìn)行維持，采用低量程DNA階梯作為大小標(biāo)記（PFG Marker）。電泳后，用溴化乙錠染色4小時(shí)，在紫外線透照器下拍照。

2.5蛋白提取與Western blot分析

藥物處理后，細(xì)胞生長(zhǎng)在30mm培養(yǎng)皿中，之后對(duì)照感染組細(xì)胞和ASFV（非洲豬瘟病毒）感染組細(xì)胞在改良的RIPA緩沖液中溶解。全細(xì)胞溶解物在病毒感染6小時(shí)和32小時(shí)后制備，首先進(jìn)行SDS-page凝膠電泳，后轉(zhuǎn)膜到0.2毫米孔徑硝化纖維素膜上，blot膜首先用5%胎牛血清（加1%吐溫）封閉1小時(shí)，之后blot膜在加有特異性抗體的PBST溶液中孵育1 h。之后blot膜用PBST溶液洗滌三次，每次10分鐘，之后用辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合的二抗孵育30分鐘，之后轉(zhuǎn)膜蛋白用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)，根據(jù)廠家說(shuō)明書(shū)（LuminataTM Crescendo, Millipore公司產(chǎn)品）。

2.6免疫印跡抗體和免疫熒光抗體分析

兔單克隆抗體抗a-微管蛋白（11H10株）由Cell Signalling Technology, Boston, USA提供，非洲豬瘟抗血清由Benedita Cruz,LNIV, Lisbon惠贈(zèng)。辣根過(guò)氧化物二抗由Jackson ImmunoResearch Lab提供。過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG（ref.111-035-003）和過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗豬IgG（ref.114-035-003）由West Grove, USA提供。免疫熒光實(shí)驗(yàn)使用了德州紅標(biāo)記的兔抗豬抗體作為二抗。防熒光猝滅使用DAPI（Vector Laboratories提供）做為介質(zhì)。為了防止熒光染料褪色，我們小心地處理了載玻片并保持在黑暗潮濕的房間期間抗體孵化項(xiàng)目。免疫熒光實(shí)驗(yàn)使用熒光顯微鏡（型號(hào)為L(zhǎng)eica DM R HC model）進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)由Photoshop CS5 軟件處理，照片由ImageJ open source 軟件處理。

2.7細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)

MTS實(shí)驗(yàn)（一種測(cè)定細(xì)胞增殖的方法）用于測(cè)定氟喹諾酮類藥物對(duì)細(xì)胞的毒性，1 x103細(xì)胞培養(yǎng)在96孔細(xì)胞版，之后細(xì)胞分別暴露在100μg/ml，50μg/ml， 25μg/ml藥物濃度下，為了確定背景值，3個(gè)孔只加藥物溶液作為對(duì)照，孔中無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)。7天過(guò)后，細(xì)胞培養(yǎng)皿中棄掉90μl的培養(yǎng)液，加上90μl的新鮮培養(yǎng)液和10μl的MTS。細(xì)胞在37 °C繼續(xù)培養(yǎng)2小時(shí)。之后細(xì)胞中加入終止液，15分鐘后輕攪孵育，在吸光度490 nm下，使用微型板閱讀器讀取數(shù)據(jù)。細(xì)胞活力由測(cè)定的值減去背景平均值得到。

3、結(jié)果

3.1加入特定氟喹諾酮類藥物后，感染非洲豬瘟病毒的細(xì)胞病變減弱

Vero細(xì)胞感染非洲豬瘟病毒后，會(huì)發(fā)生細(xì)胞病變，死亡和凋亡(Knudsen et al., 1987)。我們?cè)贏SFV感染Vero細(xì)胞中通過(guò)細(xì)胞病變來(lái)評(píng)估30種氟喹諾酮類藥物抗病毒的效果。小部分篩選的氟喹諾酮類（恩諾沙星，格列沙星，巴洛沙星，妥舒沙星，加替沙星，加雷沙星）發(fā)現(xiàn)具有抗病毒活性，在100μg/ml濃度下。圖Fig. 1A, a顯示asfv病毒感染4小時(shí)后，加入這些氟喹諾酮類，經(jīng)過(guò)7天的培養(yǎng)，僅出現(xiàn)輕微或者無(wú)細(xì)胞病變CPE。圖Fig. 1A, b顯示無(wú)氟喹諾酮類藥物處理，感染72小時(shí)后Vero細(xì)胞出現(xiàn)嚴(yán)重細(xì)胞病變。圖Fig. 1A, c為未感染ASFV的細(xì)胞，無(wú)細(xì)胞病變，圖Fig. 1A, d顯示感染的細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞崩解，細(xì)胞核斷裂，而不是細(xì)胞病變。然而，大部分單層細(xì)胞維持著未經(jīng)處理的典型成纖維細(xì)胞樣形態(tài)，而未經(jīng)藥物處理的細(xì)胞在感染12小時(shí)以后出現(xiàn)清晰的細(xì)胞病變，細(xì)胞質(zhì)/細(xì)胞核值減少。

圖:A a.用100ug/ml恩諾沙星處理細(xì)胞，感染非洲豬瘟病毒7天后后，觀察到輕微的細(xì)胞病變或無(wú)細(xì)胞病變， b.細(xì)胞感染非洲豬瘟病毒后，未用恩諾殺星處理，72小時(shí)后出現(xiàn)嚴(yán)重的細(xì)胞病變

c.細(xì)胞未感染非洲豬瘟病毒d.細(xì)胞感染非洲豬瘟病毒后，經(jīng)恩諾沙星處理后，可以看到細(xì)胞形態(tài)凋亡，細(xì)胞核崩解。

B用免疫熒光對(duì)比藥物處理的細(xì)胞a和非洲豬瘟病毒感染的細(xì)胞b ,可以看到非洲豬瘟病毒感染12小時(shí)后，細(xì)胞出現(xiàn)病變，細(xì)胞變圓，非洲豬瘟病毒染色衰減（紅色），而用藥物處理的細(xì)胞，未出現(xiàn)細(xì)胞病變。藍(lán)色為細(xì)胞核的顏色。為了解釋本圖圖例中的顏色參考，讀者可參考 文章的Web版本。）

3.2暴露于氟喹諾酮類藥物后破環(huán)了ASFV感染

為了研究氟喹諾酮類藥物對(duì)非洲豬瘟病毒的抑制，我們用PCR的方法檢測(cè)非洲豬瘟病毒DNA片段，A238L，大約720bp。在100ug/ml的藥物濃度處理下，在感染早期（即感染4小時(shí)后），可以看到非洲豬瘟病毒片段A238L顯著減少甚至檢測(cè)不到。在多種篩選的氟喹諾酮類藥物中，如圖Fig. 2A, lanes 3–29，藥物濃度越高(50, 75 到 100 ug/ml)，A238L越難檢測(cè)到，呈現(xiàn)劑量依賴。同時(shí)，圖(Fig. 2A, lanes32–57可以看到兩種氟喹諾酮類藥物（25 + 25 ug/ml 和 50 + 50 ug/ml）或3種氟喹諾酮類藥物(15 + 15 + 15 ug/ml 和 25 + 25 + 25 ug/ml)聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，能夠增強(qiáng)對(duì)非洲豬瘟病毒復(fù)制的抑制。圖Fig. 2B, lanes 5, 11, 14, 17,23 and 26顯示從經(jīng)過(guò)7天的治療后ASFV感染的Vero獲得的上清液，重新對(duì)非洲豬瘟病毒核酸陰性細(xì)胞感染7天，通過(guò)細(xì)胞毒性CPE觀察和PCR鑒定，新細(xì)胞沒(méi)有感染。表1總結(jié)了一種或多種氟喹諾酮類藥物對(duì)非洲豬瘟病毒復(fù)制的影響，通過(guò)PCR檢測(cè)。

3.2暴露于氟喹諾酮類藥物后破環(huán)了ASFV感染

為了研究氟喹諾酮類藥物對(duì)非洲豬瘟病毒的抑制，我們用PCR的方法檢測(cè)非洲豬瘟病毒DNA片段，A238L，大約720bp。在100ug/ml的藥物濃度處理下，在感染早期（即感染4小時(shí)后），可以看到非洲豬瘟病毒片段A238L顯著減少甚至檢測(cè)不到。在多種篩選的氟喹諾酮類藥物中，如圖Fig. 2A, lanes 3–29，藥物濃度越高(50, 75 到 100 ug/ml)，A238L越難檢測(cè)到，呈現(xiàn)劑量依賴。同時(shí)，圖(Fig. 2A, lanes32–57可以看到兩種氟喹諾酮類藥物（25 + 25 ug/ml 和 50 + 50 ug/ml）或3種氟喹諾酮類藥物(15 + 15 + 15 ug/ml 和 25 + 25 + 25 ug/ml)聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，能夠增強(qiáng)對(duì)非洲豬瘟病毒復(fù)制的抑制。圖Fig. 2B, lanes 5, 11, 14, 17,23 and 26顯示從經(jīng)過(guò)7天的治療后ASFV感染的Vero獲得的上清液，重新對(duì)非洲豬瘟病毒核酸陰性細(xì)胞感染7天，通過(guò)細(xì)胞毒性CPE觀察和PCR鑒定，新細(xì)胞沒(méi)有感染。表1總結(jié)了一種或多種氟喹諾酮類藥物對(duì)非洲豬瘟病毒復(fù)制的影響，通過(guò)PCR檢測(cè)。

圖2所示：（A）氟喹諾酮類藥物可抑制A238L病毒基因擴(kuò)增。在暴露于選定的單/雙/三種抗生素組合時(shí)，A238L擴(kuò)增產(chǎn)物在ASFV感染細(xì)胞中減少或缺失。6種氟喹諾酮類藥物在100 mg/ml時(shí)無(wú)病毒DNA擴(kuò)增( 5, 11, 14, 17, 23和26)，隨后在(25 + 25 mg/ml和50 + 50 mg/ml)和三種組合(15 + 15 + 15 mg/ml和25 + 25 + 25 mg/ml) 時(shí)(32-57)，一些氟喹諾酮聯(lián)合暴露可導(dǎo)致A238L病毒基因擴(kuò)增信號(hào)降低(32-43)。以模擬感染的Vero細(xì)胞和未處理的ASFV感染細(xì)胞分別作為陰性對(duì)照(1，30)和陽(yáng)性對(duì)照(2，31)。在高濃度抗生素作用下，氯氟沙星(7-9)、司帕沙星(19-21)和克林沙星(28-30)的抑制作用也降低了。凝膠圖像左側(cè)為A238L特異性基因大小。(B) 經(jīng)過(guò)7天的無(wú)藥期后，氟喹諾酮類藥物對(duì)A238L基因擴(kuò)增的抑制作用仍持續(xù)存在。氟喹諾酮治療后經(jīng)過(guò)7天的無(wú)藥期A238L擴(kuò)增的細(xì)胞培養(yǎng)均為陰性 (如5、11、14、17、23和26)。以模擬感染的Vero細(xì)胞和未處理的ASFV感染細(xì)胞分別作為陰性對(duì)照( 1，30)和陽(yáng)性對(duì)照(2，31)。凝膠圖像左側(cè)為A238L特異性基因大小。

當(dāng)vero感染細(xì)胞暴露于特定的氟喹諾酮混合物時(shí)(25 + 25mg/ml和50 + 50mg/ml和三種組合:15 + 15 + 15 mg/ml和25 + 25 + 25 mg/ml)(圖2A, 32-57)，發(fā)現(xiàn)對(duì)病毒DNA復(fù)制有顯著影響。經(jīng)過(guò)7天的治療，從感染ASFV的Vero細(xì)胞中提取上清液，進(jìn)行ASFV DNA PCR擴(kuò)增呈陰性，并且無(wú)CPE效應(yīng)、沒(méi)有感染新的細(xì)胞。(圖2B，5、11、14、17、23和26)。表1總結(jié)了通過(guò)單個(gè)和氟喹諾酮聯(lián)合使用，可充分抑制ASFV復(fù)制。

3.3 氟喹諾酮類藥物可抑制ASFV DNA的基因組碎片復(fù)制

氟喹諾酮類藥物的殺菌機(jī)理是促進(jìn)藥物-拓?fù)洚悩?gòu)酶-DNA裂解復(fù)合物的形成（Fa`bregaet al .,2009)。因此，我們的目標(biāo)是驗(yàn)證這些裂解復(fù)合物在ASFV病毒DNA上的形成。正如預(yù)期的那樣，隨著ASFV MOI(0.1, 1, 5)的增加從受感染的Vero細(xì)胞中獲得DNA塞子，表現(xiàn)為全長(zhǎng)病毒基因組的擴(kuò)增數(shù)目(線性帶170kb)，以及不完整的病毒基因組24 hpi(圖3,4-6)。  從先前暴露于恩諾沙星的受感染細(xì)胞中獲得的DNA探針顯示，完整和不完整的病毒基因組明顯減少。(（圖3）當(dāng)最高濃度使用（100 mg/ml）更加顯著（圖3，第12-14道瓊脂）。探針塞來(lái)自模擬感染細(xì)胞（0和24hpi）（圖3，泳道1和2 ）未顯示病毒基因組含量。此外，探針從暴露于依托泊苷的ASFV感染細(xì)（MOI=5），一個(gè),特異性宿主細(xì)胞拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ型毒物（1 mM）未顯示碎片基因組的增加物種，提示II型宿主拓?fù)洚悩?gòu)酶不,切割asfv病毒基因組（圖3，泳道3）。未檢測(cè)ASFV細(xì)胞基因組碎片在暴露于a氟喹諾酮藥物后（圖3，第7欄 and 11),和11欄），證實(shí)了從MTS獲得的細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果。

3.4 氟喹諾酮類調(diào)控ASFV蛋白合成

采用Western blot技術(shù)比較分析暴露于氟喹諾酮類和沒(méi)有暴露于氟喹諾酮類of viral protein synthesis between ASFV-infected Vero cellsASFV感染Vero細(xì)胞間病毒蛋白合成exposed and non-exposed to fluoroquinolones. Since early。結(jié)果顯示從早期開(kāi)始phase of infection (6 hpi), the viral protein expression in感染階段（6hpi），氟喹諾酮暴露組的細(xì)胞病毒蛋白表達(dá)fluoroquinolone-exposed cells (Fig. 4A, lanes 3–14) was（圖4a，3-14道）不同于陽(yáng)性對(duì)照組（圖4a，2道）；in exposed-cells, a small viral protein with 17 kDa was在藥物暴露的細(xì)胞中僅僅在兩條道viral proteins (63 kDa and 20 kDa) were only detected僅檢測(cè)到病毒蛋白（63kDa和20kDa）。一個(gè)17kDa的小病毒蛋白o(hù)nly clearly identified in the non-treated infected control.僅在未經(jīng)處理的感染控制中明確識(shí)別。At late phase of viral infection (32 hpi), viral proteins病毒感染后期（32hpi），病毒蛋白heavier than 50 kDa were only detected in the positive大于50kDa僅在陽(yáng)性細(xì)胞中檢測(cè)到，control (Fig. 4B, lane 2) whereas infected treated cells still對(duì)照組（圖4b，第2道），而受感染的治療細(xì)胞仍然displayed high expression levels of 35 kDa viral protein顯示了35kDa高表達(dá)水平病毒蛋白和and low levels of 17 kDa viral protein (Fig. 4B, lanes 3–低水平的17kDa病毒蛋白（圖4b，3- 14）。

3.5氟喹諾酮類藥物在有效抗病毒濃度下對(duì)細(xì)胞毒性較低

在7天的暴露期后，6種fluoroquinolones induced a cellular growth inhibition,氟喹諾酮類藥物誘導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制，使用100 mg/ml濃度下進(jìn)行MTS分析，MTS assay. The reduction observed ranged from 40% with測(cè)定結(jié)果顯示恩諾沙星生長(zhǎng)減少15%，巴洛沙星減少40%（圖5）。所有兩種或三種兩種或氟喹諾酮的組合使用中，顯示與單種使用相比，細(xì)胞毒性更低。

4、討論

非洲豬瘟病毒科、綠藻病毒科、彩虹病毒科是已知的通過(guò)編碼拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ（DNA病毒復(fù)制中關(guān)鍵的酶）來(lái)感染真核細(xì)胞的病毒屬。

此外，感染非洲豬瘟病毒的Vero細(xì)胞中在上述提到的單種抗生素100 ug/ml濃度作用7天后，PCR檢測(cè)不到病毒ASFV的A238L基因。 當(dāng)受感染的細(xì)胞暴露于氟喹諾酮聯(lián)合治療（兩種藥物50/50 ug/ml，三種藥物25/25/25 ug/ml），觀察到類似單一氟喹諾酮類作用的結(jié)果。此外，藥物處理過(guò)的感染后細(xì)胞上清液和未感染的新細(xì)胞培養(yǎng)物一樣，7天潛伏期后非洲豬瘟病毒DNA呈陰性， 無(wú)細(xì)胞病變效應(yīng)。

這些試驗(yàn)結(jié)果支持上述觀點(diǎn)：氟喹諾酮類藥物對(duì)非洲豬瘟病毒體外的感染有抑制作用，盡管病毒出現(xiàn)完全抑制作用只在早期加入氟喹諾酮類的試驗(yàn)中觀察到，這也暗示著病毒復(fù)制酶的活性峰值可能出現(xiàn)在感染的早期。

正如在細(xì)菌中的作用一樣，氟喹諾酮類與DNA回旋酶和/或拓?fù)洚悩?gòu)酶IV結(jié)合相互作用DNA復(fù)合物導(dǎo)致復(fù)制進(jìn)程受阻，從而抑細(xì)菌DNA、RNA和蛋白質(zhì)合成，導(dǎo)致快速細(xì)菌細(xì)胞死亡（Drlica和Malik，2003；Malik等人，2007年、2010年）。我們使用PFEG技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)暴露于所選氟喹諾酮類藥物的感染細(xì)胞中的完整和不完整的病毒基因組基因均明顯降低。但沒(méi)有觀察到病毒破裂后DNA碎片。這些研究結(jié)果或許可以證明氟喹諾酮類藥物通過(guò)不同的機(jī)制對(duì)非洲豬瘟病毒產(chǎn)生作用。像其他人研究者指出的那樣，PFEG可以檢測(cè)高達(dá)250kb的小DNA片段（Birren和Lai，1994年）。因?yàn)猷Z酮類治療可以影響細(xì)菌染色體DNA片段（例如金黃色葡萄球菌中30 kbp或大腸桿菌中的100 kbp） ，這些藥物對(duì)ASFV的影響似乎與病毒染色體分裂無(wú)關(guān)。因此，氟喹諾酮類應(yīng)作為ASFV拓?fù)洚悩?gòu)酶II可逆抑制劑，與細(xì)菌中描述的作用機(jī)制相反。可能氟喹諾酮類藥物會(huì)對(duì)ASFV拓?fù)洚悩?gòu)酶的鏈轉(zhuǎn)移活性干擾從而影響其ATP酶活性，通過(guò)抑制 ATP水解的最后一步會(huì)阻斷DNA復(fù)制。兩種抑制機(jī)制在復(fù)制叉前產(chǎn)生的扭轉(zhuǎn)\復(fù)制壓力，雖然沒(méi)有導(dǎo)致基因組斷裂但導(dǎo)致病毒DNA以及病毒蛋白的減少 。

同樣值得注意的是，與未處理的ASFV感染細(xì)胞相比。暴露于依托泊苷（一種特定宿主細(xì)胞拓?fù)洚悩?gòu)酶II抑制劑）的ASFV感染的細(xì)胞中完整/不完整的ASFV基因片段未顯示明顯下降。這一結(jié)果有力地表明了宿主拓?fù)洚悩?gòu)酶II不經(jīng)常參與病毒基因組復(fù)制，提示這種宿主酶ASFV所用。

關(guān)于病毒蛋白合成，免疫印跡分析顯示在感染的早期（6 hpi）和晚期（32 hpi）ASFV感染的Vero細(xì)胞，未處理和處理之間出現(xiàn)嚴(yán)重差異。在細(xì)菌和真核細(xì)胞中報(bào)道（Baldwin和Osheroff，2005；Drlica等人,2008；Malik等人，2010）病毒蛋白合成的延遲是因?yàn)锳SFV基因組的拓?fù)鋸?fù)雜性，減少了新的病毒基因組數(shù)量，從而影響病毒/宿主轉(zhuǎn)錄過(guò)程，損害病毒蛋白質(zhì)翻譯（Baldwin和Osheroff，2005；Drlica等人，2008年；Malik等人，2010年）。

在缺乏抗ASF疫苗的情況下，早期診斷以及實(shí)施嚴(yán)格的生物安全措施，包括淘汰撲殺是消除其傳播唯一的戰(zhàn)略?？共《局委熢贏SF的爆發(fā)周邊地區(qū)的應(yīng)用，可以在一定程度上控制疾病。該試驗(yàn)證明了識(shí)別和鑒定抗病毒藥物分子這一努力是正確的。有可能代表未來(lái)ASF的替代控制方法 。

我們的研究結(jié)果表明，6種氟喹諾酮類藥物具有很強(qiáng)的抗ASFV作用。因此，這些藥物分子被認(rèn)為是可能治療ASFV感染的潛在工具，當(dāng)然進(jìn)一步的研究這些藥物在體內(nèi)效果是十分必要的。

5、基金

這項(xiàng)研究通過(guò)項(xiàng)目PTDC/CVT/105630/2008和兩個(gè)博士獎(jiǎng)學(xué)金(SFRH/BD/72872/2010 and SFRH/BD/65532/2009).

2010和SFRH/BD/65532/2009)得到了‘Fundacao para a Cienciae Tecnologia’基金的支持。

6、利益沖突

作者聲明對(duì)當(dāng)前手稿沒(méi)有利益沖突 。

*文章來(lái)源：In vitro antiviral activity of fluoroquinolones against African swine fever virus；2013年發(fā)表在Veterinary Microbiology雜志，影響因子IF：3.127