美國農(nóng)業(yè)部研究機構利用納米孔測序技術快速鑒定非洲豬瘟病毒基因組

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非洲豬瘟病毒（ASFV）是非洲豬瘟病毒科家族的唯一成員，是一種大型（200nM）復雜的囊膜雙鏈DNA病毒。ASFV可感染家豬和野豬，擴散快，致死率高（可達100%），對豬業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟后果。

近期，美國農(nóng)業(yè)部下屬的研究機構在Journal of Clinical Microbiology雜志上發(fā)表了針對非洲豬瘟病毒的首個結合樣品富集、納米孔MinION測序技術、以及新型快速分析軟件的報告，實現(xiàn)對該病毒基因組序列的真正實時檢測。

由于目前尚無控制非洲豬瘟（ASF）的有效疫苗，基于檢測追蹤、流行病學調查、減少人員接觸以及消毒等控制措施，在當病毒脫落或其他的病毒和細菌感染產(chǎn)生相似的癥狀時，這些方法就會變得非常復雜。因此，分子水平進行早期快速檢測和診斷有益于早期發(fā)現(xiàn)和更加有效的控制豬瘟。

美國農(nóng)業(yè)部國家獸醫(yī)服務實驗室等研究機構比較了現(xiàn)有的測序平臺，發(fā)現(xiàn)基于NGS平臺的工作流程需要大量資源進行樣本和測序文庫準備，檢測周期長（最少17個小時來獲取原始數(shù)據(jù)），儀器投入資本高。另外，ASFV基因組大小約為180kb，兩端為反向重復序列，該病毒的大小也一直阻礙著獲得其全基因組序列的研究工作。而在滿足快速檢測和鑒定ASFV的需求上，MinION測序儀具備了低前期投資成本、快速樣本制備方案、可生成有效覆蓋基因組的長讀長序列、可直接讀取DNA，并且能夠實時生成數(shù)據(jù)的優(yōu)勢。

基于便攜式MinION納米孔測序，他們開發(fā)出了非洲豬瘟快速分析測序工具（ASF-FAST）和富集策略，能夠在數(shù)分鐘內獲得并快速分析非洲豬瘟病毒基因組，該方法有助于高效的緊急管理和疾病控制干預，減少經(jīng)濟損失。結果顯示測序開始后的6分鐘內便檢測到ASFV的特異讀長，無論起始材料，均能夠在10分鐘內生成足夠的數(shù)據(jù)完成ASFV的基因組分析（高達100%）。該研究成果發(fā)表在Journal of Clinical Microbiology雜志。DOI: 10.1128/JCM.01104-19。

在實驗中，研究小組比較了未處理樣品和富集樣品的序列特異度和時間，發(fā)現(xiàn)從富集的樣品中識別到ASFV基因組更快，更富特異性。在富集的樣品中，生成總讀長序列54743個，其中23208個含有ASFV特異性序列（42.39%），生成的第一個原始讀長即識別到了99%的基因組；對于未處理的樣品，生成了4307個總讀長序列，其中868個含有ASFV特異性序列（20.15%）。另外，去除甲基化宿主DNA提升了病毒特異性測序性能。

在生成完整基因組序列所需的時間方面，富集樣本速度更優(yōu)于未處理樣本：生成99%的基因組序列，富集后的樣本僅需不到10分鐘，而未處理樣本則需要64分鐘。證實將長讀長納米孔測序技術與ASF-FAST軟件結合使用，能夠經(jīng)濟快速，實時地從診斷樣品中分離出完整的ASFV基因組。

在評估MinION平臺用于流行病學評估的快速鑒定的可行性方面，作者使用ASF -FAST軟件分析了四株遺傳學上不同的ASFV分離株的序列數(shù)據(jù)。他們發(fā)現(xiàn)在測序運行開始的10分鐘內，所有富集樣本90%的基因組均得到了解析。使用新鮮的和凍干血液樣本，全基因組序列可在約4小時內獲得。

作者在文章最后表示，納米孔技術作為一種重要的工具，能夠被世界其它許多受ASFV威脅的地方和地區(qū)所利用進行快速監(jiān)視，應用于那些沒有復雜基礎設施的實驗室和現(xiàn)場。大多數(shù)實驗室都可以以最小的資金投入輕松獲得MinION設備，迅速拓展能力進行對ASFV的表征。

近期，中國科學院武漢病毒研究所劉翟課題組也利用納米孔測序技術成功解析一例非洲豬瘟病毒基因組。

制版人：半夏

來源：BioArt