酶制劑在飼料養(yǎng)殖中發(fā)揮替代抗生素作用的領(lǐng)域及其機(jī)理

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抗生素減停對(duì)飼料養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了持續(xù)挑戰(zhàn)，為此，人們不斷研究在飼料配方和養(yǎng)殖過(guò)程中代替抗生素的技術(shù)和尋找有效的替代產(chǎn)品，各種技術(shù)措施和替代產(chǎn)品不斷出現(xiàn)，不同理論假說(shuō)和應(yīng)用效果眾說(shuō)紛紜，這些情況大部分都有一定的效果和依據(jù)。但是，到目前為止，還沒(méi)有哪一種技術(shù)和產(chǎn)品能夠簡(jiǎn)單代替抗生素的作用，而只能部分接近其效能，因?yàn)槿魏渭夹g(shù)措施和產(chǎn)品都有其獨(dú)特性。從實(shí)踐角度，許多技術(shù)措施和替代產(chǎn)品已經(jīng)在嘗試或者應(yīng)用，2019年《國(guó)際家禽》雜志對(duì)養(yǎng)禽業(yè)從業(yè)者進(jìn)行了一個(gè)世界范圍的調(diào)查，受訪者包括養(yǎng)禽業(yè)主、飼料配方師、獸醫(yī)師等相關(guān)人員，結(jié)果顯示：“為替代和補(bǔ)充促生長(zhǎng)類抗生素對(duì)家禽生產(chǎn)性能和健康的益處，有機(jī)酸、益生菌和酶制劑被列為最受歡迎的三種抗生素替代品，受歡迎程度分別是 65%、61%和 54%。有機(jī)酸、益生菌和酶制劑是最有效的飼料添加劑，其有效性分別是 74%、70%和68%”。所以，在眾多潛在的抗生素替代產(chǎn)品中，最受歡迎的抗生素替代產(chǎn)品和最有效的飼料添加劑都是有機(jī)酸、益生菌和酶制劑。當(dāng)然，這些調(diào)查統(tǒng)計(jì)只能作為一種參考，不能就此排除其他產(chǎn)品，因?yàn)轱暳吓浞降亩鄻有院宛B(yǎng)殖條件的復(fù)雜性，決定了沒(méi)有一套簡(jiǎn)單的技術(shù)措施和路徑。無(wú)論如何，從上面的調(diào)查顯示，飼料酶制劑具有替代抗生素的潛在價(jià)值。在筆者的兩部專著（馮定遠(yuǎn)等，2011、2020）和試驗(yàn)研究報(bào)告（馮定遠(yuǎn)，2017）中，部分內(nèi)容都涉及酶制劑在替代抗生素應(yīng)用。

1、酶制劑替代飼用抗生素的目標(biāo)

很難消化的日糧可以維持?jǐn)?shù)量更多的腸道微生物，添加最有效的酶，可以最大程度地減小菌群數(shù)量。Bedford 等（2004）討論到，飼喂家禽中等營(yíng)養(yǎng)水平的小麥基礎(chǔ)日糧，使用以木聚糖酶為主的酶制劑，可使微生物數(shù)量降低60%。因?yàn)槭褂每股乜梢灾苯幼饔糜谀繕?biāo)細(xì)菌，所以與酶制劑相比，更能顯著地降低菌群的數(shù)量。盡管酶制劑和抗生素都使菌群數(shù)量減少，但二者的作用方式顯然有很大的差別?？股馗纳粕a(chǎn)性能的機(jī)理很多，如降低小腸中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的競(jìng)爭(zhēng)；因?yàn)榭刂屏瞬≡鴾p少了局部炎癥的發(fā)生；因?yàn)楦纳屏讼屎筒≡亩ㄖ捕档土四c道的厚度和長(zhǎng)度（Thomke等，1998a、b）。后兩種作用機(jī)制導(dǎo)致更有效的消化，降低了維持的能量需要。而酶制劑的作用效果是使腸道的菌群數(shù)量和細(xì)菌種類的變化（Brenes 等，1992、1993；Gollnisch 等，1996；Hock 等，1997；Simon，1998；Vahjen 等，1998）。

抗生素作為飼料添加劑的目的包括兩個(gè)方面，一是促生長(zhǎng)作用，提高飼料報(bào)酬，改善動(dòng)物的生產(chǎn)性能；二是抑菌抗病作用，改善健康狀況，提高動(dòng)物成活率和整齊度，這兩方面又有關(guān)聯(lián)性。所以，針對(duì)這兩個(gè)目的，無(wú)抗日糧使用的代替抗生素產(chǎn)品也就分為兩個(gè)類型，即直接替代性產(chǎn)品（替代抗菌抑菌功能）和間接替代性產(chǎn)品（替代促生長(zhǎng)功能）。酶制劑是其中的一類可以替代抗生素的產(chǎn)品，而且由于酶的種類和功能廣泛，同時(shí)具有抗生素的兩種功能，即促生長(zhǎng)和抗菌功能，例如葡萄糖氧化酶、溶菌酶等可以殺菌抑菌；而外源消化酶（蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶）、植酸酶、非淀粉多糖酶等可以提高動(dòng)物的生產(chǎn)性能。這是酶制劑的多種功能的一部分，酶制劑在畜禽飼料中有七種功能，包括：
①營(yíng)養(yǎng)利用功能；
②腸道健康功能；
③生理調(diào)控功能；
④免疫調(diào)控功能；
⑤脫毒解毒功能；
⑥抑菌殺菌功能；
⑦抗氧化功能。
其中一些功能與抗生素的作用接近或相同。酶制劑的多功能性既源于酶種類的多樣性，也與酶制劑在飼料養(yǎng)殖中應(yīng)用技術(shù)的變化搭配有關(guān)，從使用技術(shù)角度，飼料酶有七種類型產(chǎn)品，單一的一種單酶（或者一類酶）無(wú)法簡(jiǎn)單滿足抗生素功能的替代。但可以根據(jù)目的，使用復(fù)合酶、組合酶、配合酶、組合型復(fù)合酶或者組合型配合酶，當(dāng)然，沒(méi)有技術(shù)性的混合酶是不能解決實(shí)際問(wèn)題的。

抗生素在促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)的作用方式仍然未被完全理解，圍繞代替抗生素的作用，最基本的是從動(dòng)物腸道微生物、微生態(tài)及其病變等腸道健康方面考慮。

根據(jù)抗生素在飼料養(yǎng)殖中應(yīng)用的目的及機(jī)理，在酶制劑中，有五個(gè)領(lǐng)域酶制劑具有間接或者直接替代抗生素的潛力，具體包括：
①具有直接營(yíng)養(yǎng)消化功能，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)的酶制劑，如蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等；
②能夠降低日糧黏性，減少有害微生物繁殖的酶制劑，如木聚糖酶、葡聚糖酶、纖維素酶等非淀粉多糖酶；
③通過(guò)降低日糧免疫原性造成的免疫應(yīng)激，減少腸道病變壞死的酶制劑，如蛋白酶、β-甘露聚糖酶、α-半乳糖苷酶等；
④能夠直接殺滅細(xì)菌，抑制病原菌產(chǎn)生危害的酶制劑，如葡萄糖氧化酶、溶菌酶、過(guò)氧化氫酶等；
⑤通過(guò)產(chǎn)生功能性寡糖和寡肽，控制有害微生物的酶制劑，如木聚糖酶、纖維素酶、蛋白酶等。

酶制劑的這些替抗功能不能簡(jiǎn)單的直接代替，它們是條件性的，而且有些可能發(fā)揮重要作用，一些是輔助性的、次要的，不能簡(jiǎn)單夸大酶制劑在這方面的作用。在這些酶制劑中，選擇有針對(duì)性的酶制劑進(jìn)行搭配組合，特別是在傳統(tǒng)的復(fù)合酶配制的基礎(chǔ)上，應(yīng)用我們提出的組合酶和配合酶的理論（馮定遠(yuǎn)等，2011、2020），可以代替過(guò)去使用的飼用抗生素在日糧中應(yīng)用。

2 、通過(guò)提高日糧消化，代替抗生素

營(yíng)養(yǎng)代謝功能的酶制劑
歐洲專家 Sheppy 早在 2004 就指出：歐盟最先頒布了飼料中禁止使用某些抗生素作為促生長(zhǎng)劑這個(gè)決定，迫使飼料生產(chǎn)企業(yè)努力尋找替代品，酶制劑成為首選的措施。事實(shí)上，其本意是酶制劑的促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)消化和利用，代替抗生素的促生產(chǎn)作用。同樣，Thor⁃pe等（2004）也評(píng)論到：歐盟禁止了促生長(zhǎng)的抗生素在動(dòng)物日糧中的使用，這對(duì)動(dòng)物生產(chǎn)性能以及健康狀況的影響仍需進(jìn)一步研究和探討。禁用抗生素可能導(dǎo)致動(dòng)物生產(chǎn)性能下降，外源酶制劑也許可以減輕其消極后果。也就是說(shuō)酶制劑可以減少因限制使用促生長(zhǎng)抗生素而帶來(lái)的損失。

酶制劑在飼料養(yǎng)殖中的應(yīng)用
最早的初衷是酶制劑能夠幫助動(dòng)物提高日糧的消化利用，到目前為止，酶制劑的營(yíng)養(yǎng)功能仍然是最重要的考慮。酶制劑改善營(yíng)養(yǎng)消化利用的途徑大體有三個(gè)方面：
①直接補(bǔ)充消化道營(yíng)養(yǎng)水解所需的酶，消化蛋白質(zhì)、碳水化合物和脂類的酶；
②間接去除飼料中抗?fàn)I養(yǎng)因子；
③間接增加動(dòng)物內(nèi)源消化酶分泌。

第一種途徑是一種酶制劑單一提高一類營(yíng)養(yǎng)的消化利用，如蛋白酶只能提高蛋白質(zhì)消化利用, 作用明確。第二、第三種途徑是一種酶制劑有可能同時(shí)提高幾類營(yíng)養(yǎng)的消化利用，如木聚糖酶和植酸酶理論上可以提高所有營(yíng)養(yǎng)的消化利用，作用綜合復(fù)雜。最早在畜禽飼料中使用第一代酶制劑的想法就是源于蛋白酶、淀粉酶或脂肪酶可以直接補(bǔ)充體內(nèi)消化道相應(yīng)消化酶不足的單一和對(duì)應(yīng)原理。而另外某些酶制劑間接通過(guò)去除抗?fàn)I養(yǎng)因子，提高營(yíng)養(yǎng)成分的消化率。例如，木聚糖酶、β-葡聚糖酶、纖維素酶和植酸酶，最終提供更多可利用的營(yíng)養(yǎng)。添加植酸酶能夠提高蛋白質(zhì)和氨基酸的消化率，而不僅僅是植物磷的利用效率。還有某些酶制劑通過(guò)誘導(dǎo)動(dòng)物內(nèi)源消化酶分泌，提高營(yíng)養(yǎng)的消化利用。添加淀粉酶和其他一些酶，可增加動(dòng)物內(nèi)源消化酶分泌，提高飼料轉(zhuǎn)化率和動(dòng)物生長(zhǎng)率（沈水寶，2002）。

我們前期研究了許多外源消化酶改善動(dòng)物生產(chǎn)性能，通過(guò)補(bǔ)充內(nèi)源酶不足，可以增加消化以減少未消化營(yíng)養(yǎng)在后腸道過(guò)度代謝帶來(lái)對(duì)抗生素需求的增加。研究表明在肉雞日糧中添加α-淀粉酶可以顯著提高肉雞的平均日增重，降低料肉比。淀粉酶提高畜禽的生產(chǎn)性能的主要原因：改善腸道形態(tài)，增加絨毛長(zhǎng)度，降低隱窩深度；提升內(nèi)源酶活力，如脂肪酶，蛋白酶等；增加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)載體的基因表達(dá)量，如SGLT1、GLUT2 等（趙世元，2014）。日糧中添加外源蛋白酶可以改善畜禽的生產(chǎn)性能，提高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化利用率。肉雞日糧中添加不同菌種來(lái)源的蛋白酶能顯著降低耗料增重比，同時(shí)顯著提高回腸末端氨基酸的表觀消化率（吳建東，2014）。在低蛋白日糧中添加蛋白酶能夠顯著改善斷奶仔豬的生產(chǎn)性能，提高飼料利用率，顯著提高斷奶仔豬總能、粗蛋白的表觀消化率（黃升科，2011）。同時(shí)蛋白酶可以不同程度改善斷奶仔豬腸道完整性，提高內(nèi)源消化酶的活力以及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)載體的基因表達(dá)（凌寶明，2011）。幼齡動(dòng)物通常脂肪酶分泌不足，添加外源脂肪酶能夠緩解脂肪酶缺乏造成的負(fù)面影響。在低能量日糧中添加脂肪酶，能夠顯著改善黃羽肉雞的生產(chǎn)性能，達(dá)到正常能量日糧肉雞水平（雷建平，2012）。提高屠宰率和全凈膛率，改善雞肉品質(zhì)（劉昌鎮(zhèn)，2012）。

3、通過(guò)降低日糧黏性，代替抗生素

減少有害微生物繁殖的酶制劑
黏性日糧的可溶性、大分子量的非淀粉多糖一方面能干擾營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收，另一方面導(dǎo)致腸道微生物大量繁殖，消耗營(yíng)養(yǎng)（Bedford等，1998）?？股卮偕L(zhǎng)劑在日糧中的使用，腸道黏度是主要考慮因素（Choct，2004）。酶制劑促進(jìn)腸道健康的功能：一是與酶制劑功能的物理作用相關(guān)，通過(guò)降低黏性；二是與生化代謝作用相關(guān)，酶制劑產(chǎn)生的寡糖可促進(jìn)腸道正常蠕動(dòng)，促進(jìn)有益菌的增殖,抑制有害菌的定植。

酶制劑可以調(diào)節(jié)腸道健康，最典型的具有促進(jìn)腸道健康功能的酶制劑是非淀粉多糖酶(包括木聚糖酶、β-葡聚糖酶、β-甘露聚糖酶等)。

抗生素可以顯著改善飼喂高非淀粉多糖（NSP）日糧的家禽的生產(chǎn)性能（Mac Auliffe 等，1971；Misir等，1978a、b）。無(wú)論哪一種原因，家禽小腸中過(guò)量的發(fā)酵可能不利于小腸的消化和吸收，日糧中添加非淀粉多糖酶制劑可能會(huì)緩解這種狀況?；蛟S是通過(guò)降低小腸中食糜黏度，加速了食糜的通過(guò)和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化率（通過(guò)除去黏性膠質(zhì)的抑制擴(kuò)散作用），因此微生物發(fā)酵的底物和發(fā)酵時(shí)間均減少，使得其繁殖減慢。這可恢復(fù)正常和有效的小腸中淀粉和蛋白質(zhì)的消化（酶解作用）（Choct，2004）。

外源性酶制劑的添加降低了小麥和黑麥基礎(chǔ)日糧的黏度，結(jié)果是減少了小腸菌群的數(shù)量（Choct 等，1996；Hock 等，1997）。酶制劑的添加增加了小腸中淀粉和蛋白質(zhì)的排空速度，減少了微生物發(fā)酵所需要的底物。Choct等（1996）認(rèn)為酶制劑與腸道健康是動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)的下一個(gè)挑戰(zhàn)，NSP酶作為抗生素替代物，在家禽業(yè)中對(duì)影響經(jīng)濟(jì)效益的腸道壞死病(necrotic enteritis NE)的作用明顯，酶制劑對(duì)黏性日糧造成的腸道壞死病有預(yù)防作用，特別是產(chǎn)氣莢膜梭菌（C. per⁃fringens）等有害微生物造成的腸道炎癥。

豬方面的研究也有類似的結(jié)果，非淀粉多糖分解后可能產(chǎn)生寡糖抑制后腸道有害細(xì)菌生長(zhǎng)，減少腸道傳染病和降低腹瀉率。黏性日糧與大腸炎綜合癥，可溶性纖維是影響非特異大腸炎綜合癥的關(guān)鍵因素，尤其是對(duì)于采食黏性的小麥基礎(chǔ)日糧（顆粒飼料）的生長(zhǎng)豬，添加木聚糖酶可以改善這種情況。酶制劑的使用可降低因日糧而導(dǎo)致的腹瀉，尤其是斷奶仔豬更明顯（Inborr 等，1988；Florou-Paneri 等，1998；Kantas等，1998）。不少研究者特別強(qiáng)調(diào)，這些作用以及酶與治療或亞治療劑量的抗生素所具有的協(xié)同作用（Flo⁃rou- Paneri 等 ，1998；Kantas 等 ，1998；Gollnisch 等 ，1996），為未來(lái)的生產(chǎn)方式（不單純依賴抗生素的生產(chǎn)方式）提供了可能性（Partridge，2004）。

控制酶添加效應(yīng)的許多因子與影響抗菌素添加效應(yīng)的因素一樣（Bedford 等，2004）?？股氐奶砑有?yīng)與動(dòng)物的生長(zhǎng)環(huán)境有關(guān)，普通動(dòng)物比無(wú)菌動(dòng)物對(duì)抗生素的添加效應(yīng)更明顯。飼喂家禽營(yíng)養(yǎng)合理的小麥基礎(chǔ)日糧，使用以木聚糖酶為主的酶制劑，可使微生物數(shù)量降低 60%?？咕氐氖褂靡蛑苯幼饔糜谀繕?biāo)細(xì)菌，而顯著降低細(xì)菌數(shù)量的程度比酶制劑更迅速。這兩種降低細(xì)菌數(shù)量的方式是不一樣的。

本課題組前期多項(xiàng)研究表明，小麥代替玉米的肉雞日糧中，添加木聚糖酶可以顯著提高肉雞的生產(chǎn)性能，提高日增重，降低料肉比（于旭華，2004；徐昌領(lǐng)，2011；李秧發(fā)，2010；廖細(xì)古，2006）。β-甘露聚糖酶在玉米-豆粕型基礎(chǔ)及低能量日糧中，對(duì)肉雞飼料轉(zhuǎn)化率均有顯著提高（閆曉陽(yáng)，2013）。非淀粉多糖造成的食糜黏性增加，不僅阻礙內(nèi)源消化酶活力，也抑制內(nèi)源消化酶的分泌。添加非淀粉多糖酶對(duì)內(nèi)源消化酶的活力及分泌具有顯著改善。木聚糖酶能提高小腸食糜中蛋白酶、脂肪酶及淀粉酶的活力，增加小腸黏膜中麥芽糖酶和蔗糖酶的分泌（李忠良，2011）。纖維素酶對(duì)雛鵝十二指腸內(nèi)容物胰蛋白酶、糜蛋白酶、淀粉酶活性具有顯著提高作用（楊彬，2004）。腸道微生物過(guò)度增殖是非淀粉多糖影響畜禽健康的重要因素，而非淀粉多糖酶的添加對(duì)腸道微生物有著顯著的影響。木聚糖酶能夠顯著增加肉雞后腸中乳酸桿菌的豐度，減少大腸桿菌的豐度（辛錦蘭，2011）。纖維素酶在肉鵝高纖維日糧中顯著降低了盲腸內(nèi)容物大腸桿菌的數(shù)量（黃燕華，2004）。非淀粉多糖酶對(duì)梭狀芽孢桿菌等有害菌的增殖有抑制作用（Jackson等，2003）。非淀粉多糖造成的食糜黏性使得腸黏膜層變厚，腸壁厚度增加，降低了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，而非淀粉多糖酶能有效地改善畜禽腸道形態(tài)，增加絨毛長(zhǎng)度，降低隱窩深度，提高腸道緊密連接蛋白ZO-1、Occludin和Claudin-1基因表達(dá)量，從而提高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的表觀消化率和能量真消化率（李忠良，2011；雷釗，2013）。

4、通過(guò)直接殺滅細(xì)菌，代替抗生素

抑制病原菌危害的酶制劑
最典型的具有病原菌殺菌抑菌功能的酶制劑是葡萄糖氧化酶和溶菌酶，飼料中添加葡萄糖氧化酶是替抗、減抗的有效手段。馮定遠(yuǎn)（2016）討論綜合了葡萄糖氧化酶在日糧中替代抗生素的機(jī)理和應(yīng)用價(jià)值。葡萄糖氧化酶的作用是催化葡萄糖氧化分解，造成兩個(gè)結(jié)果：一是消耗環(huán)境中氧，造成厭氧環(huán)境；二是產(chǎn)生葡萄糖酸，維持酸性環(huán)境，這兩個(gè)方面都對(duì)微生物特別是病原性細(xì)菌是不利的。而另一種酶過(guò)氧化氫酶能夠?qū)⑦^(guò)氧化氫分解生成水和氧，而后水又與葡萄糖酸內(nèi)酯結(jié)合產(chǎn)生葡萄糖酸。

葡萄糖氧化酶主要是通過(guò)非營(yíng)養(yǎng)、非消化方式改善消化道的內(nèi)環(huán)境和微生態(tài)，通過(guò)三個(gè)途徑對(duì)病原菌殺菌、抑菌，其一通過(guò)氧化葡萄糖，生成葡萄糖酸，降低胃腸道內(nèi)酸性，酸性環(huán)境有利于抑制病原菌；其二通過(guò)氧化反應(yīng)消耗胃腸道內(nèi)氧含量，營(yíng)造厭氧環(huán)境，厭氧環(huán)境有利于抑制病原菌；其三反應(yīng)產(chǎn)生一定量過(guò)氧化氫，過(guò)氧化氫的氧化能力是廣譜殺菌，大部分腸道病原菌都是耗氧菌，大部分有益微生物都是厭氧菌或兼性厭氧菌，消耗氧氣有助于增殖有益菌。對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌、巴氏桿菌、葡萄球菌、弧菌等有害菌進(jìn)行抑制，達(dá)到維持腸道菌群平衡，保證動(dòng)物健康。作用機(jī)理有別于抗生素，不會(huì)產(chǎn)生抗藥性或藥物殘留，為綠色生態(tài)養(yǎng)殖提供了另一條通途。

葡萄糖氧化酶替抗作用及其機(jī)理
主要是由于葡萄糖氧化酶作用于病原菌的物理生存環(huán)境，能專一分解β-D-葡萄糖成為葡萄糖酸和過(guò)氧化氫，同時(shí)消耗大量的氧氣。葡萄糖氧化酶作為一種新型的飼料添加劑具有部分的抗生素效果，例如提高動(dòng)物生產(chǎn)性能 ，保 護(hù) 腸 道 健 康 和 增 強(qiáng) 動(dòng) 物 免 疫 力（Tang 等 ，2016）。葡萄糖氧化酶的生理功能主要表現(xiàn)在兩個(gè)方面：①制造厭氧環(huán)境，增加腸道酸性，消除腸道病菌生存環(huán)境，抑制病原菌的生長(zhǎng)。葡萄糖氧化酶進(jìn)入腸道，以葡萄糖作為底物，生成葡萄糖酸和過(guò)氧化氫。

過(guò)氧化氫具有廣譜殺菌作用，可以起到抑制大腸桿菌、沙門氏菌等致病微生物生長(zhǎng)繁殖的作用（楊久仙等，2011）；葡萄糖氧化酶消耗氧氣形成的厭氧環(huán)境，抑制有害菌的生長(zhǎng)，促進(jìn)有益菌，形成優(yōu)勢(shì)菌群，改善腸道菌群，保護(hù)腸道健康；生成的葡萄糖酸具有酸化劑的功效，促進(jìn)胃腸道食糜產(chǎn)生更多的短鏈脂肪酸，改善腸道微生態(tài)（Tsukahara 等，2002）。②保護(hù)腸道上皮細(xì)胞完整，處于應(yīng)激或病理狀態(tài)的動(dòng)物會(huì)產(chǎn)生大量自由基，當(dāng)自由基超過(guò)機(jī)體自身的清除能力時(shí)就會(huì)破壞腸道上皮細(xì)胞；添加葡萄糖氧化酶可以清除這些自由基，能保護(hù)腸道上皮細(xì)胞的完整性，阻止大量病原菌的入侵，提高免疫力，促進(jìn)動(dòng)物健康快速生長(zhǎng)（呂進(jìn)宏等，2004）。目前研究葡萄糖氧化酶對(duì)畜禽腸道微生物的影響主要通過(guò)體外抑菌試驗(yàn)和針對(duì)特異菌種的檢測(cè)，然而探索葡萄糖氧化酶對(duì)如何改善畜禽整體的微生物區(qū)系，將會(huì)為其應(yīng)用提供更加充分的理論基礎(chǔ)。

同時(shí)，葡萄糖氧化酶還具有抗氧化作用，能有效清除自由基，保護(hù)腸道上皮細(xì)胞的完整性，使球蟲侵入腸道上皮寄生部位的機(jī)會(huì)大大降低，從而達(dá)到防御球蟲的目的。添加葡萄糖氧化酶仔豬的血清SOD和GSH-Px含量水平，跟無(wú)抗生素組相比，都有顯著性升高（P<0.05）。和無(wú)抗生素組相比，肝臟中的 GSH-Px含量水平有顯著性的提高（P<0.05）。由此說(shuō)明葡萄糖氧化酶可增強(qiáng)斷奶仔豬的抗氧化能力，從而降低斷奶仔豬的腸道炎癥反應(yīng)，維持腸道健康和穩(wěn)態(tài)，減少腹瀉（陳嘉銘，2019）。

在我們的研究中，玉米豆粕型肉雞日糧中添加葡萄糖氧化酶與空白組和抗生素組相比，葡萄糖氧化酶組平均日增重分別提高 5.08%和 2.09%，平均日采食量分別提高 1.83%和 0.01%，料肉比分別降低3.11%和 1.97%；葡萄糖氧化酶對(duì)腸道形態(tài)亦有改善作用，增加絨毛高度，提高腸道物理屏障相關(guān)基因表達(dá)，如ZO-1、Occludin等。此外葡萄糖氧化酶減輕了腸道免疫反應(yīng)，降低相關(guān)炎癥基因的表達(dá)，如IL-1β、IL-4 及 IL-8 等。盲腸內(nèi)容物 16S rDNA 分析發(fā)現(xiàn)添加葡萄糖氧化酶相比于對(duì)照組和抗生素組可以顯著提高肉雞盲腸食糜中的 OTU 值，表明葡萄糖氧化酶促進(jìn)腸道菌群的多樣性，也證實(shí)抗生素對(duì)腸道菌群整體的破壞。葡萄糖氧化酶可以降低擬桿菌門的相對(duì)豐度，提高放線菌門的相對(duì)豐度以及厚壁菌門與擬桿菌門的比值，對(duì)擬桿菌門的擬桿菌科和紫單胞菌科，厚壁菌門中的瘤胃菌科和毛螺旋菌科的相對(duì)豐度都有顯著的影響?？股貙?duì)腸道菌群的影響較為劇烈，對(duì)有益菌和有害菌的無(wú)差別的殺滅作用，長(zhǎng)期使用抗生素能夠造成腸道菌群動(dòng)態(tài)的失衡。而葡萄糖氧化酶對(duì)腸道微生物的作用與抗生素相似，但相對(duì)溫和，特別是對(duì)有益菌的抑制作用。因此，葡萄糖氧化酶對(duì)腸道菌群結(jié)構(gòu)有一定的改善作用（黃婧溪，2018）。

過(guò)氧化氫酶是基于消減自由基維護(hù)機(jī)體氧化還原平衡、控制氧化損傷來(lái)降低對(duì)抗生素需求。正常生理活動(dòng)下，體內(nèi)氧自由基的產(chǎn)生與清除處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。當(dāng)畜禽周圍環(huán)境驟變或者處于特殊的生理狀況，會(huì)導(dǎo)致自由基大量產(chǎn)生，超過(guò)機(jī)體的清除速度，自由基就會(huì)在體內(nèi)過(guò)量累積，就會(huì)出現(xiàn)氧化應(yīng)激。而過(guò)量的自由基破壞腸道組織中DNA、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等生物大分子，造成腸道氧化應(yīng)激損傷，導(dǎo)致動(dòng)物腹瀉、腸炎、菌群紊亂等，影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，從而損害動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育（李維等，2016）。過(guò)氧化氫酶是動(dòng)物植物體內(nèi)廣泛存在的末端氧化酶，又稱為“觸酶”，是參與活性氧代謝的重要因子之一，與超氧化物歧化酶、過(guò)氧化物酶等共同組成了生物體內(nèi)活性氧防御系統(tǒng)，在清除氧自由基方面發(fā)揮重要作用。過(guò)氧化氫酶的主要作用就是通過(guò)催化電子對(duì)的轉(zhuǎn)移將H2O2轉(zhuǎn)化為對(duì)機(jī)體無(wú)害的水和氧氣，從而清除體內(nèi)堆積的超氧陰離子和減少生成羥自由基等強(qiáng)活性的自由基，同時(shí)有效降低自由基對(duì)腸上皮細(xì)胞的損傷，從而維護(hù)仔豬腸道結(jié)構(gòu)的完整性。

本課題組研究表明：日糧添加過(guò)氧化氫酶能有效替代氧化鋅在斷奶仔豬中的應(yīng)用。24日齡斷奶仔豬基礎(chǔ)日糧中分別添加氧化鋅和過(guò)氧化氫酶，飼養(yǎng)14 d，結(jié)果表明，添加過(guò)氧化氫酶顯著降低料肉比和腹瀉率；改善腸道形態(tài)，顯著提高絨毛高度，降低隱窩深度；減輕仔豬的氧化應(yīng)激，提高抗氧化能力，顯著降低血清中丙二醛的含量，提高血清中谷胱甘肽的含量和超氧陰離子的抑制能力。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明過(guò)氧化氫酶能顯著降低過(guò)氧化氫對(duì)腸道上皮細(xì)胞的損傷，增加細(xì)胞活力（方銳，2017）。過(guò)氧化氫酶能改善母豬的繁殖性能和抗氧化能力。母豬妊娠后期添加過(guò)氧化氫酶能一定程度提高總產(chǎn)仔數(shù)；血液和初乳中的總抗氧化能力和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化氫酶的活力均有顯著地提高；對(duì)仔豬的腹瀉率也有顯著的降低（張志東，2017）。研究證明，外源添加過(guò)氧化氫酶能有效地幫助動(dòng)物清除氧自由基，提高機(jī)體的抗氧化能力，緩解氧自由基造成的損傷，改善動(dòng)物生產(chǎn)性能，達(dá)到減抗替抗的效果。

另外一類殺菌的酶制劑是通過(guò)對(duì)細(xì)菌細(xì)胞壁水解，這些酶包括溶菌酶、β-甘露聚糖酶、殼聚糖酶和β-葡聚糖酶等。溶菌酶是一種作用于β-1，4糖苷鍵的細(xì)胞壁溶解酶；也有作用于肽“尾”和酰胺部分的細(xì)胞壁溶解酶。目前微生物溶菌酶分5種：①內(nèi)N-乙酰己糖胺酶，此酶同于雞蛋清溶菌酶，破壞細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖中的β-1，4糖苷鍵；②酰胺酶，切斷細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖中NAM與肽“尾”之間的N-乙酰胞壁酸-L-丙氨酸鍵；③內(nèi)肽酶，使肽“尾”及肽“橋”內(nèi)的肽鍵斷裂；④β-1，3、β-1，6葡聚糖酶和甘露聚糖酶，此酶分解酵母細(xì)胞的細(xì)胞壁；⑤殼聚糖酶，這是分解霉菌細(xì)胞壁的一種溶菌酶。

除了溶菌酶和葡萄糖氧化酶直接殺菌抑菌外，還有一個(gè)特別的酶制劑代替抗生素抑菌例子，例如脂肪酶。某些脂肪酶它不是通過(guò)營(yíng)養(yǎng)作用，而是直接抑制病原微生物。Dierick等（2002、2004）利用含有中鏈脂肪酸的油脂和脂肪酶的協(xié)同作用，在模擬胃環(huán)境（37 ℃、pH值3~6、3 h）下的組合水解試驗(yàn)表明，適量添加脂肪酶能部分釋放中短鏈脂肪酸，特別是月桂酸、丁酸一類產(chǎn)物。試驗(yàn)表明這些中鏈脂肪酸能夠調(diào)節(jié)和穩(wěn)定胃腸道微生物群系，對(duì)有害微生物的生長(zhǎng)具有顯著的抑制作用，起到類似抗生素的作用。由此推測(cè)，脂肪酸和脂肪酶的合理組合可能起到降低仔豬飼料中抗生素使用量的作用。

除了對(duì)細(xì)菌有殺滅作用外，某些特別的酶制劑也顯示對(duì)病毒有抑制作用。我們正在進(jìn)行的試驗(yàn)也顯示果膠酶能夠產(chǎn)生一些產(chǎn)物，具有抑菌的潛能（張?jiān)矗?020）。

所以，根據(jù)作用機(jī)理，有抑菌作用的酶大體有四類：葡萄糖氧化酶和過(guò)氧化氫酶等通過(guò)厭氧條件、溶菌酶和殼聚糖酶等作用細(xì)胞壁、脂肪酶產(chǎn)生的特別是中短鏈脂肪酸、果膠酶等系列產(chǎn)物，這需要進(jìn)一步總結(jié)。

5、通過(guò)降低日糧免疫原性，代替抗生素

減少腸道病變壞死的酶制劑
某些特別的非淀粉多糖能刺激動(dòng)物固有免疫系統(tǒng)，刺激機(jī)體產(chǎn)生多余的免疫反應(yīng)，消耗能量，影響生產(chǎn)性能。通過(guò)添加抗生素能夠降低日糧中非淀粉多糖對(duì)畜禽造成的消極影響（Teirlynck 等，2009），而針對(duì)性的非淀粉多糖酶也有類似效果。非淀粉多糖的種類很多，只有少數(shù)才具有免疫原性。其中具有復(fù)雜側(cè)鏈異多糖的β-甘露聚糖，特別是β-半乳甘露聚糖具有免疫原性，它產(chǎn)生的免疫應(yīng)激與抗原蛋白不同。由于與病原（致病菌）相關(guān)分子模式（Pathogen Associated Molecular Pattern, PAMP）相似，動(dòng)物腸道上存在相應(yīng)的抗原的模式識(shí)別受體（PRR），它能夠與β-半乳甘露聚糖結(jié)合引起免疫應(yīng)激，造成腸道潰瘍等炎癥，同時(shí)造成營(yíng)養(yǎng)特別是能量的消耗。Hsiao等（2006）認(rèn)為：β-半乳甘露聚糖由于與組成多種病原體（致病菌）的表面成分（Surface Components of Multi&#8259;ple Pathogens，SCMP）相似，能夠刺激特有的免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致無(wú)目的性的能量損耗的免疫反應(yīng)。腸道上的受體（PRR）與β-半乳甘露聚糖的 PAMP 結(jié)合引起免疫應(yīng)激，可通過(guò)測(cè)定血清中α-1-酸性糖蛋白(AGP)作為免疫反應(yīng)指標(biāo)。最近進(jìn)行的瓜爾豆來(lái)源的β-半乳甘露聚糖也顯示其對(duì)腸道免疫功能的影響（付饒，2020）。

這種免疫反應(yīng)導(dǎo)致慢性炎癥，β-甘露聚糖酶可以減少由于免疫反應(yīng)造成的肉雞壞死腸炎損害，與艾美球蟲和產(chǎn)氣莢膜梭菌（C. Perfringens）的侵襲模式相同。飼料源性免疫反應(yīng)（feed induced immune re&#8259;sponse, FIIR）導(dǎo)致的長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)免疫應(yīng)激，所造成的能量等營(yíng)養(yǎng)消耗的累積是明顯的，將影響動(dòng)物生產(chǎn)性能。特異性β-甘露聚酶可消除β-半乳甘露聚糖的免疫原性。

Arsenault 等（2017）通過(guò)對(duì)相關(guān)蛋白磷酸化信號(hào)的數(shù)據(jù)分析表明：在含有瓜爾豆粕日糧中添加β-甘露聚糖酶可以消除β-半乳甘露聚糖造成的飼料源性免疫反應(yīng)（FIIR），降低免疫信號(hào)。β-甘露聚糖酶也可以降低免疫球蛋白 IgG 的產(chǎn)生（Li 等，2010）、降低粒性白細(xì)胞（Mehri 等，2010）、降低免疫器官法氏囊和脾臟的相對(duì)重量（Ferreira 等，2016）。所以，特殊的非淀粉多糖（例如β-甘露聚糖）不僅能造成食糜黏性，降低動(dòng)物生產(chǎn)性能，同時(shí)能造成動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，導(dǎo)致能量流失，降低生產(chǎn)性能（Hsiao等，2006）。

Teirlynck 等（2009）研究發(fā)現(xiàn)高非淀粉多糖的小麥日糧能誘導(dǎo)腸壁中的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)并誘導(dǎo)上皮細(xì)胞的凋亡，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)具有低水平可溶性NSP的谷物如玉米。Ferreira等（2016）添加β-甘露聚糖酶能減少脾臟和法氏囊的相對(duì)重量，同時(shí)降低血液中IgA，IgG和IgM 的含量，減少免疫反應(yīng)耗用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，改善生產(chǎn)性能。Arsenault 等（2017）通過(guò)激酶組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)在肉雞日糧中額外添加β-甘露聚糖能激活多個(gè)免疫相關(guān)的信號(hào)通路，而β-甘露聚糖酶能消除對(duì)應(yīng)的免疫信號(hào)。表明非淀粉多糖酶能夠減輕飼料源性造成腸道免疫反應(yīng)，類似抗生素的作用效果。Partridge（2004）認(rèn)為酶制劑是防止豬的非特異大腸炎綜合癥的關(guān)鍵因素，為未來(lái)的生產(chǎn)方式，特別是不單純依賴抗生素的生產(chǎn)方式，提供了可能性。

除了特異性的β-半乳甘露聚糖具有免疫原性，長(zhǎng)時(shí)間造成的免疫反應(yīng)而導(dǎo)致動(dòng)物腸道的壞死性腸炎外，大分子的蛋白，特別是豆科的大豆蛋白引起幼年哺乳動(dòng)物的腸道免疫反應(yīng)也是人們關(guān)注的一個(gè)課題。大豆蛋白的免疫原性引起的腸道損害與β-半乳甘露聚糖的性質(zhì)是不一樣的，但都會(huì)引起腸道的病變，只能通過(guò)抗生素來(lái)加以克服，斷奶仔豬日糧離不開(kāi)抗生素的原因也在這里?？乖鞍椎膯?wèn)題一般是通過(guò)膨化或者發(fā)酵處理加以克服，而蛋白酶，特別是應(yīng)用多種性質(zhì)不同的蛋白酶組成的組合酶，理論上是可以解決其免疫原性問(wèn)題，在仔豬無(wú)抗日糧的配制中，高效、有針對(duì)性的蛋白酶也是應(yīng)該考慮的一個(gè)措施，但專門關(guān)注研究的并不多。

6、通過(guò)產(chǎn)生功能性寡糖和寡肽，代替抗生素

控制有害微生物的酶制劑
抗生素在飼料養(yǎng)殖中應(yīng)用的功能是綜合性的，替代抗生素的技術(shù)措施也是多樣性的，這也是為什么到目前為止，替抗技術(shù)與產(chǎn)品五花八門，良莠不齊。既有技術(shù)和產(chǎn)品本身的因素，也有認(rèn)識(shí)和技術(shù)水平的因素。由于酶制劑種類繁多，功能復(fù)雜。酶制劑除了上面四個(gè)具有比較明確的替抗領(lǐng)域外，還有比較間接的應(yīng)用領(lǐng)域，即酶制劑水解產(chǎn)物，部分酶解產(chǎn)生的功能性寡糖和寡肽具有調(diào)節(jié)腸道健康的作用，在替抗方面起到輔助的作用，作為益生元的功能性寡糖（低聚糖）尤為明顯。根據(jù)腸道微生態(tài)平衡和微生物菌群調(diào)節(jié)的特點(diǎn)，利用酶制劑的干預(yù)機(jī)制，我們提出了益生型飼料酶制劑的理論（馮定遠(yuǎn)等，2020）。

產(chǎn)生寡糖等功能性酶解產(chǎn)物實(shí)現(xiàn)減抗替抗作用，低聚糖被認(rèn)為以益生元的形式發(fā)揮作用。低聚糖一般經(jīng)過(guò)胃和小腸而不被消化吸收，直接到達(dá)動(dòng)物后腸段，被有益菌利用，生成乙酸、丙酸和丁酸等短鏈脂肪酸，不僅能為腸黏膜細(xì)胞提供能量，促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝，還可以降低結(jié)腸內(nèi)pH值環(huán)境，抑制有害菌的生長(zhǎng)。高度難消化日糧維持更大數(shù)量的腸道微生物，酶的添加使得菌群數(shù)量最大程度地減小，木聚糖酶可使微生物數(shù)量降低60%。肉仔雞小麥日糧中添加木聚糖酶，導(dǎo)致利用淀粉和蛋白的細(xì)菌數(shù)量減少（Vahjen等，1998），利用木糖的微生物數(shù)量增加，酶處理組的細(xì)菌總數(shù)僅有對(duì)照組的40%。高纖維日糧中添加纖維素酶可顯著減少盲腸內(nèi)容物大腸桿菌數(shù)，同時(shí)顯著增加了有益的乳酸桿菌數(shù)。

在我們的研究中，肉雞日糧中添加低聚木糖和乳酸桿菌配伍能提高肉雞的飼料轉(zhuǎn)化率，改善血清中IGF-1的含量；能夠改善肉雞腸道形態(tài)，提高腸道緊密連接蛋白ZO-1、Occludin和F11 的基因表達(dá)量，抑制有害菌的增殖，增加有益菌豐度（Yusuf，2014）。以小麥作為酶解底物，添加不同類型的木聚糖酶，進(jìn)行體外酶解。采用高效液相色譜測(cè)定木聚糖水解產(chǎn)物的組成，結(jié)果表明酶解產(chǎn)物85%以上集中在木二糖及木三糖。利用酶解產(chǎn)物培養(yǎng)細(xì)菌發(fā)現(xiàn)，其對(duì)乳酸桿菌和枯草芽孢桿菌有顯著的增殖作用；此外發(fā)現(xiàn)，木聚糖水解產(chǎn)物能夠顯著降低大腸桿菌對(duì)腸道上皮細(xì)胞的黏附率，減少細(xì)胞 LDH 的釋放量，降低大腸桿菌對(duì)細(xì)胞的損傷作用（雷釗，2013）。馬巖（2015）研究發(fā)現(xiàn)木二糖和木三糖均能促進(jìn)乳酸桿菌和枯草芽孢桿菌的增殖，并且減少大腸桿菌和沙門氏菌對(duì)雞腸道上皮細(xì)胞的黏附，緩解對(duì)細(xì)胞造成的損傷。雛雞盲腸微生物檢測(cè)得到相似的結(jié)果。為了進(jìn)一步了解低聚木糖對(duì)細(xì)菌的影響，本課題組通過(guò)分別添加5 mg/ml的木糖、木二糖、木三糖、木四糖、木五糖及木六糖于鼠傷寒沙門氏菌培養(yǎng)基中連續(xù)體外培養(yǎng)36 h，分點(diǎn)測(cè)定吸光值，發(fā)現(xiàn)木糖、木五糖及木六糖均能顯著抑制沙門氏菌的增殖；經(jīng)5 mg/ml的木糖及低聚木糖培養(yǎng)4 h后的鼠傷寒沙門氏菌均顯著降低對(duì) IPEC-J2 的黏附率，其中以木糖效果最好，黏附率降低 49.3%，其余組分降低的比例分別為 27.13%、37.04%、17.48%、21.91%、41.20%。通過(guò)測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)基中 LDH 的含量發(fā)現(xiàn)，木糖及低聚木糖均能不同程度緩解鼠傷寒沙門氏菌對(duì)細(xì)胞的損傷。經(jīng)轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，木糖及低聚木糖影響沙門氏菌活動(dòng)的各個(gè)方面，而可能通過(guò)改變其生長(zhǎng)、黏附相關(guān)基因 galk、speA、smpB 的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)頡頏作用（歐陽(yáng)海燕，2017）。低聚糖可能通過(guò)直接黏附在細(xì)菌表面，以及通過(guò)影響?zhàn)じ较嚓P(guān)基因的表達(dá)，改變腸道中存在的有害菌的黏附潛力（Ebersbach 等，2012）。揭示了低聚糖在抑菌方面代替促生長(zhǎng)抗生素的潛力，所以，木聚糖酶的添加，可以產(chǎn)生功能性寡糖，起到協(xié)同替代抗生素的作用，當(dāng)然，這種功能可能是潛在的、輔助的和累積的，未必能夠達(dá)到顯著的性能改善水平。

總而言之，酶制劑代替抗生素在飼料養(yǎng)殖中的應(yīng)用包括五類酶具有間接或者直接替代抗生素的潛力，具有直接營(yíng)養(yǎng)消化功能，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)的酶制劑；能夠降低日糧黏性，減少有害微生物繁殖的酶制劑；通過(guò)降低日糧免疫原性，減少腸道病變壞死的酶制劑；能夠直接殺滅細(xì)菌，抑制病原菌產(chǎn)生危害的酶制劑；通過(guò)產(chǎn)生功能性寡糖和寡肽，控制有害微生物的酶制劑。它們的作用機(jī)理是通過(guò)影響腸道的物理性狀、生化條件、微生態(tài)平衡和組織結(jié)構(gòu)的完整性等幾方面實(shí)現(xiàn)。酶制劑的替抗功能具有條件性、輔助性和累積性的特點(diǎn)，只有在復(fù)合酶的基礎(chǔ)上，應(yīng)用組合酶和配合酶及益生型酶制劑的理論才能配制高效的飼料酶制劑添加劑，達(dá)到代替過(guò)去使用的飼用抗生素在日糧中應(yīng)用的目的。

來(lái)源：預(yù)混料家園
作者：馮定遠(yuǎn)