嘌呤法測定瘤胃微生物蛋白

huig5182005

瘤胃微生物蛋白質(zhì)產(chǎn)量的測定

嘌呤法

一、操作方法樣本的嘌呤分析

1、準(zhǔn)確稱取0.5克充分干燥（用凍干機(jī)干燥）的食糜樣本，或分離所得的食糜微生物部分樣本，置于25ml具塞帶刻度的試管內(nèi)。注意：樣本必須是干燥的，否則會導(dǎo)致核酸水解不完全。

2、加入2.5ml高氯酸(Hclo4,70%)，緊蓋瓶口，然后將其放在90~95℃的恒溫水浴內(nèi)培養(yǎng)1小時(shí)。此時(shí)樣本即炭化，形成黑色硬結(jié)。最好是將硬結(jié)破碎，以利反應(yīng)完全。

3、再加入17.5ml乙種PH緩沖液(NH4H2PO4,0.0285M)，充分搖動(dòng)，緊蓋瓶口，重新置于90~95℃的恒溫水浴內(nèi)培養(yǎng)10~15分鐘，然后通過Whatman 4號濾紙過濾，此時(shí)濾液的PH值為2左右。

4、取0.5ml濾液轉(zhuǎn)移到容積為15ml的離心管內(nèi)。分別加入0.5ml AgNO3(0.4M)和9ml甲種PH緩沖液(NH4H2PO4,0.2M)。然后置于暗處至少30分鐘。最好是將其放置過夜(5℃)，可提高分析的準(zhǔn)確度。

5、于4000rpm離心15分鐘，然后小心地棄去上清液。注意不要攪動(dòng)瓶底的沉淀物。

6、用PH為2的蒸餾水洗離心分離所得沉淀物一次。用與第5步同樣的方法離心，棄去上清液。

7、加入10ml 0.5N的鹽酸溶液，充分搖動(dòng)，使其與沉淀物混勻?yàn)橹埂?/div>

8、用具塞密封離心管，放在90~95℃的恒溫水浴內(nèi)培養(yǎng)30分鐘。

9、用紫外分光光度計(jì)于260nm處比色，測得的嘌呤濃度用RNA當(dāng)量表示。

酵母RNA（中國科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所）

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定：準(zhǔn)確稱取0.05,0.10,0.15,0.20,0.25,0.30,0.4,0.50克酵母RNA，分別置于8個(gè)25ml的具塞帶刻度的試管內(nèi)，按上述分析樣本內(nèi)嘌呤含量的操作方法進(jìn)行處理，最后于260nm處比色。