豬瘟研究新進(jìn)展

kinki0396 · 發(fā)表于 2007-9-11 09:40:45

豬瘟(Hog cholera or Classical Swine fever, CSF)是由豬瘟病毒(Hog cholera virus or Classical Swine fever Virus，CSFV)引起豬的一種高度接觸性傳染病。其流行廣泛，發(fā)病率高，死亡率高。1984年世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為A類傳染病，我國(guó)也將此病列為一類動(dòng)物疫病。

一、病原學(xué)
豬瘟病毒(Hog cholera or Classical Swine fever virus, CSFV)為黃病毒科(Flaviviridae)，瘟病毒屬(Pestivirus)。在本屬內(nèi)包括牛黏膜病(即牛病毒性腹瀉)病毒(Bovine viral diarrhea disease virus BVD-MDV)和綿羊邊界病毒(Border disease virus, BDV)，均與CSFV在結(jié)構(gòu)、抗原性上密切相關(guān)即存在著屬共同抗原。
CSFV呈球形，含有單股正鏈RNA，其核心外面被有脂蛋白囊膜，完整的病毒粒子直徑約為40-50 nm。中心有20面體立體對(duì)稱核衣殼長(zhǎng)29 nm，囊膜表面伸展出許多長(zhǎng)達(dá)6-8 nm的糖蛋白纖突結(jié)構(gòu)。
CSFV的抵抗力較強(qiáng)，血液中的病毒在37℃可存活7 d, CSFV在細(xì)胞培養(yǎng)物中60℃10 min失去活性，在脫纖血中CSFV 68℃30 min被滅活。病毒在pH5~10的環(huán)境中穩(wěn)定。最適宜生長(zhǎng)的pH值為5.2。在2%氫氧化鈉15min可使尿中病毒死亡，血液中的病毒則需1 h。在豬肉和豬肉制品中的CSFV能保持其感染性達(dá)數(shù)年之久。
CSFV只有1個(gè)血清型，但病毒株的毒力有強(qiáng)、中、弱之分。1974年，法國(guó)學(xué)者Aynaud將CSFV分成A, B兩群，A群包括流行的強(qiáng)毒株和人工培育的弱毒株，B群包括自然分離的無(wú)毒、低毒和中毒株。1977年，日本上條泰雄將CSF株分成H, B群，不易被牛黏膜病陽(yáng)性血清中和的病毒株稱H群(強(qiáng)毒株)，易被中和的病毒株稱B群(毒力比H群弱)。
根據(jù)對(duì)CSFV結(jié)構(gòu)蛋白基因的分析，繪出CSFV的遺傳發(fā)生樹(shù)(Phylogenetictree)。將CSFV劃分為2個(gè)群即I群和2群。1群中又分了2個(gè)亞群，亞群1 .1和亞群1 .2；2群中又分為3個(gè)亞群，亞群2 .1、亞群2.2和亞群2.3；國(guó)際上將CSFV分為3個(gè)基因群共10個(gè)亞群。我國(guó)目前流行著2個(gè)基因群共4個(gè)基因亞群，即基因2群中的2 .1、2.2、2.3亞群和基因1群中的1 .1亞群，明確了我國(guó)CSFV在世界CSFV譜系中的位置?；?/font>2群在我國(guó)CSF流行中占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，在110個(gè)野毒中有93.6%屬于這一群，其中2.1和2 .2是我國(guó)主要流行的基因亞群，基因1群在我國(guó)CSFV流行中作用較弱，標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒石門株與疫苗兔化弱毒株屬1 .1亞群成員。這表明全國(guó)范圍內(nèi)流行毒與石門毒的遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)。經(jīng)遺傳研究發(fā)現(xiàn)我國(guó)廣泛流行的基因2群毒株中的每一個(gè)亞群都能在系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)上找到遺傳關(guān)系十分接近而早就流行于歐洲的毒株，甚至是流行于歐洲野豬群中的毒株。

二、流行病學(xué)
      1、傳染來(lái)源
病豬是主要的傳染源。其次是病后帶毒豬、潛伏帶毒豬，隱性帶毒豬也是重要的傳染源。病毒由尿、糞和其他分泌物排出，污染環(huán)境，散播傳染。
      2、傳播途徑
易感豬采食污染病毒的食物和飲水后（特別是洗肉水和泔水），主要經(jīng)扁桃體、口腔黏膜、呼吸道黏膜感染?；疾』蛉醵局旮腥镜哪肛i，可使胎兒發(fā)生胎盤感染，產(chǎn)生弱胎、死胎、木乃伊胎，有的胎兒產(chǎn)出后發(fā)生先天性震顫，共濟(jì)失調(diào)，存活豬可發(fā)生持續(xù)性的病毒感染。
      3、易感動(dòng)物
豬和野豬均易感染，其他動(dòng)物有抵抗力。
      4 、流行特點(diǎn)
（1） CSF流行范圍廣 CSF的流行和發(fā)病特點(diǎn)自20世紀(jì)70年代以后就發(fā)生了很大的變化，這種變化是世界性的，不局限于一時(shí)一地。其流行形式已從頻繁發(fā)生的大流行轉(zhuǎn)為周期性、波浪式的地區(qū)性或散發(fā)性流行，通常3~4年1個(gè)周期，疫點(diǎn)顯著減少。我國(guó)CSF發(fā)生為區(qū)域性流行或散發(fā)。本病在歐洲、亞洲、非洲均有發(fā)生。
（2）發(fā)病日齡小
發(fā)病豬多見(jiàn)于3月齡或90日齡以下，特別是剛出生的仔豬和10日齡以內(nèi)的仔豬多見(jiàn)，而育肥豬和種豬很少發(fā)病。
（3）發(fā)病溫和
非典型CSF是我國(guó)流行的主要病型，在臨床和病理解剖特征不典型，發(fā)病率與死亡率顯著降低，病程明顯延長(zhǎng)。種豬的持續(xù)感染和初生仔豬的先天感染較為普遍，這種感染的豬臨床呈健康狀態(tài)。為此，這類病豬是CSF流行最危險(xiǎn)的傳染源。
（4）持續(xù)性感染
是繁殖母豬發(fā)生CSF潛伏感染的一種主要方式，被感染的母豬由于機(jī)體有一定的抵抗力，一般情況下不表現(xiàn)臨床癥狀，但卻不斷地向外界排毒，或者通過(guò)胎盤將病毒傳給胎兒。當(dāng)環(huán)境發(fā)生變化時(shí)，如母源抗體低下，飼養(yǎng)管理不善、長(zhǎng)途運(yùn)輸?shù)染杉ぐl(fā)感染。另一特點(diǎn)是持續(xù)感染能造成妊娠母豬流產(chǎn)，有的產(chǎn)生免疫麻痹即免疫耐受現(xiàn)象。這些感染母豬通常易被忽視，成為最主要的傳染來(lái)源。2001年，中國(guó)獸藥監(jiān)察所王在時(shí)教授首次在國(guó)內(nèi)建立了CSF持續(xù)性感染的動(dòng)物模型。持續(xù)感染可造成妊娠母豬的帶毒綜合征，使妊娠母豬發(fā)生流產(chǎn)、死胎和弱仔等繁殖障礙類疾病。其表現(xiàn)為產(chǎn)出病豬出生3日內(nèi)發(fā)病，還常見(jiàn)于斷奶后仔豬15~60日齡發(fā)病，但成年豬很少發(fā)病，借此說(shuō)明我國(guó)豬群中普遍存在著持續(xù)感染問(wèn)題。
（5）胎盤感染和免疫耐受
胎盤感染和免疫耐受現(xiàn)象是某些規(guī)模豬場(chǎng)發(fā)生CSF的重要原因之一。母豬在妊娠期間，胎兒通過(guò)胎盤感染了來(lái)自母體的CSFV而造成先天性感染，這些感染胎兒出生后多死于仔豬先天性震顫。由于先天感染了CSFV仔豬就對(duì)該病毒產(chǎn)生了免疫耐受而不表現(xiàn)臨床癥狀，但在注射疫苗時(shí)卻不產(chǎn)生免疫應(yīng)答，當(dāng)條件不適應(yīng)時(shí)即可發(fā)生CSFV。
（6）免疫力低下
在養(yǎng)豬業(yè)方面，雖然業(yè)主十分重視CSF疫苗的注射，但各豬場(chǎng)的免疫劑量和免疫程序有一定的差異，普遍存在免疫力低下的現(xiàn)象，免疫過(guò)的豬只時(shí)有CSF的發(fā)生，這就是人們所說(shuō)的“免疫失敗”現(xiàn)象。發(fā)生免疫低下有二種情況:一是疫苗注射劑量不足。CSF兔化弱毒疫苗均系采用犢牛睪丸細(xì)胞進(jìn)行生產(chǎn)的，大陸生物制品的合格判定標(biāo)準(zhǔn)低于國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)。因免疫劑量不足所產(chǎn)生的低水平抗體不能有效地保護(hù)機(jī)體和清除感染的病毒，從而使感染轉(zhuǎn)入持續(xù)階段。二是持續(xù)感染和先天感染。這2種情況均可導(dǎo)致免疫耐受現(xiàn)象，即對(duì)疫苗注射的免疫應(yīng)答反應(yīng)遲鈍，這可謂免疫力低下的最主要的原因。
（7）混合感染和并發(fā)癥
由于CSFV的持續(xù)性感染和仔豬免疫耐受，機(jī)體對(duì)CSF兔化弱毒疫苗的免疫應(yīng)答反應(yīng)遲鈍，致使機(jī)體免疫力低下，此時(shí)易與豬繁殖與呼吸障礙綜合征、豬偽狂犬病、豬弓形體、豬丹毒、豬肺疫等混合感染，尚可并發(fā)仔豬副傷寒、大腸桿菌病、鏈球菌病和附紅細(xì)胞體病等，導(dǎo)致病情復(fù)雜，癥狀嚴(yán)重，防治效果不佳，發(fā)病率和死亡率增高，經(jīng)濟(jì)損失巨大。
三、臨床癥狀
典型CSF根據(jù)臨床癥狀的表現(xiàn)程度和持續(xù)時(shí)間可將CSF分為4種類型：最急型、急性型、亞急性型、慢性型。
最急型
突然發(fā)病，高熱稽留，皮膚、粘膜發(fā)紺、有出血點(diǎn)，與其他急性敗血癥類似，病程1~8 d，通常5d內(nèi)死亡。
急性型
最常見(jiàn)，多數(shù)于發(fā)病后10~20 d內(nèi)死亡。體溫高達(dá)41℃~42℃，稽留、畏寒。眼角有多量粘性膿性黃白色分泌物。先便秘，后腹瀉，時(shí)有嘔吐。發(fā)病初期皮膚充血，紫紺，出血，鼻端、耳、四肢、腹下、會(huì)陰等處明顯。公豬包皮積尿。有些仔豬可見(jiàn)神經(jīng)癥狀，磨牙、運(yùn)動(dòng)失調(diào)，昏睡和痙攣等。
亞急性型
亞急性型較急性型緩和。耳、四肢、腹下、會(huì)陰等處皮膚有出血點(diǎn)，病程長(zhǎng)達(dá)20 d左右。
慢性型
主要表現(xiàn)消瘦，貧血，全身衰竭。常伏臥，行走無(wú)力，有時(shí)輕熱，食欲不振，便泌和腹瀉交替。有的皮膚呈紫斑或呈死痂。其病程可達(dá)30 d以上。
非典型 CSF(溫和型) 本病型系由低毒力毒株引起。皮膚通常無(wú)出血現(xiàn)象，死亡多集中在仔豬，臨床癥狀輕微，病變不典型。主要表現(xiàn)體溫在40℃~41℃，極少數(shù)在41℃以上，鼻鏡干燥、口渴、減食，排黃色尿液。便秘呈長(zhǎng)期性，糞便混有血液、粘液或偽膜。口腔咽喉、軟顎、扁桃體有壞死點(diǎn)或潰瘍。有的病豬四肢和腹下部存有瘀血斑。病的后期發(fā)育停滯，跗關(guān)節(jié)腫大，后肢癱瘓，站立不穩(wěn)。
繁殖障礙型
妊娠母豬感染低毒力病毒株時(shí)，可使妊娠母豬出現(xiàn)繁殖障礙，發(fā)生流產(chǎn)、弱產(chǎn)、死胎、木乃伊胎、畸形胎、弱仔胎。弱仔胎是外表健康的先天感染的仔豬，可終生帶有病毒血癥，一生中不斷地向外界排毒。它的存在是最危險(xiǎn)的傳染源。
四、病理學(xué)變化
急性、亞急性CSF 呈現(xiàn)多發(fā)性出血為特征的敗血癥變化。在皮膚、漿膜、粘膜、淋巴結(jié)、心肺、膀朧、膽囊等處常有不同程度的出血變化，通常為斑點(diǎn)狀。心臟：心冠脂肪有針尖大小的出血點(diǎn)或出血斑。肝臟：無(wú)特征變化。脾臟：一般不腫大，被膜上特別是邊緣?？梢?jiàn)到隆起的紅色小出血點(diǎn)。有50%~70%病例，脾臟邊緣有狼牙狀梗死，呈紫黑色，稍隆起。這是本病的特征性病變。淋巴結(jié)：外表腫大，呈暗紅色。切面呈彌漫性出血或周邊出血，中心部仍有灰白色區(qū)域，紅白相間如大理石樣。腘淋巴結(jié)：切面呈車輪狀出血，這一特征病變具有一定的指導(dǎo)意義。腎臟：腎臟表面有針尖大小的出血點(diǎn)或出血斑，俗稱“麻雀蛋”樣，皮質(zhì)和髓質(zhì)或腎盂出血點(diǎn)時(shí)有出現(xiàn)。
慢性型出血病變輕微，壞死性腸炎明顯。在回腸末端及盲腸和結(jié)腸，其炎癥從淋巴濾胞開(kāi)始，向外發(fā)展，形成扣狀腫(壞死)，呈褐色和黑色，中央低陷，突出粘膜表面，特別是回盲口有輪層狀潰瘍，呈同心輪狀，有的脫落，如繼發(fā)感染沙門氏菌，則在輪狀潰瘍的基礎(chǔ)上，又有彌漫性壞死性腸炎變化。此外，由于鈣磷代謝的紊亂，斷奶病豬肋骨末端與軟骨交界處發(fā)生鈣化，可見(jiàn)有黃色骨化線，這在慢性豬瘟診斷上有一定的意義。
非典型豬瘟(溫和型) 腎、膀朧、淋巴結(jié)出血變化少見(jiàn)；扁桃體充血、水腫、化膿性壞死、潰瘍?；孛た诹馨徒Y(jié)濾胞腫脹，有呈輪層狀潰瘍；膽囊腫脹，出血、潰瘍；胃底有片狀充血或出血。
繁殖障礙型流產(chǎn)胎兒表皮出血、全身水腫，頭、肩、前肢水腫，頭、四肢畸形；有的產(chǎn)木乃伊胎；小腦、肺發(fā)育不全，肝臟灶狀壞死；正產(chǎn)胎兒出生后數(shù)日內(nèi)死亡，可見(jiàn)各臟器和皮膚出血；其他病理變化不典型。

五、CSF的診斷
世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將CSFV列為A類動(dòng)物傳染病。迅速作出診斷是撲滅疫情，減少損失的關(guān)鍵。
      1、臨床綜合診斷
根據(jù)CSFV的流行病學(xué)特點(diǎn)、臨床癥狀、病理變化進(jìn)行綜合判定。
      2、病毒學(xué)診斷
主要檢測(cè)在組織中或組織(細(xì)胞)培養(yǎng)物中的病毒。
（1）病毒的分離與培養(yǎng)
將病豬的扁桃體、脾臟或淋巴結(jié)，剪成2g大小的組織塊，加上滅菌砂在研缽內(nèi)研成勻漿。用Hank' s液或MEM配成20%懸液，加上青霉素使終濃度為500 IU/ml和鏈霉素終濃度為500 ug/ml，室溫下放置1 h, 3000 r/min離心15 min，取上清液。將PK-15單層細(xì)胞用胰酶消化分散后800 r/min離心10 min，用5%胎牛血清(無(wú)BVDV)的MEM配成2x610個(gè)細(xì)胞/ml懸液。將9份細(xì)胞懸液和1份病料懸液接種于轉(zhuǎn)瓶或微量細(xì)胞培養(yǎng)板，另設(shè)不加病料的對(duì)照若干瓶(孔)，于接種后1, 2, 3 d，分別將培養(yǎng)物及對(duì)照物用Hank' s液或MEM液洗滌2次，每次5 min，用冷丙酮固定10 min。然后，進(jìn)行免疫酶染或免疫熒光染色，鏡檢。
（2）家兔接種試驗(yàn) CSFV感染家兔以后病毒不能使其發(fā)病，但能使機(jī)體產(chǎn)生抗體，而豬瘟兔化弱毒則能使家兔機(jī)體發(fā)生定型熱反應(yīng)。將CSF病料用抗生素處理后，接種家兔，經(jīng)7d后再用CSF兔化弱毒靜脈注射，每隔6h測(cè)溫1次，連續(xù)3d，如發(fā)生定型熱反應(yīng)，則不是CSF，否則即是CSF。同時(shí)設(shè)對(duì)照組，不接種CSF病料，僅接種CSF兔化弱毒，應(yīng)出現(xiàn)定型熱反應(yīng)。這種方法適合于現(xiàn)場(chǎng)，特異性強(qiáng)，但需時(shí)較長(zhǎng)。
（3）熒光抗體試驗(yàn) 1965年，Robertson等首次利用熒光抗體(Fluorescent antibody, FA)檢測(cè)CSF病料和組織培養(yǎng)物。采取CSF早期病豬的扁桃體和淋巴結(jié)或晚期病豬的脾和腎等組織，制備冰凍切片或組織印片，丙酮固定后用CSF熒光抗體染色檢查，出現(xiàn)綠色熒光為陽(yáng)性結(jié)果，否則為陰性。
（4）酶標(biāo)抗體組織印片（酶標(biāo)抗體試驗(yàn)）
采取可疑病豬的血，分離白細(xì)胞制成涂片或以脾、腎、扁桃體作成印片，進(jìn)行酶標(biāo)抗體染色，在細(xì)胞漿成特異的棕色斑點(diǎn)即為陽(yáng)性反應(yīng)。
（5）反向間接血凝試驗(yàn)
用CSFV抗體致敏醛化鞣酸化綿羊紅細(xì)胞，制成反向間接血凝標(biāo)準(zhǔn)抗體(診斷試劑)，檢測(cè)待檢物中的病毒。當(dāng)豬只感染后1~3d就可以從血液中檢出病毒，以脾、淋巴結(jié)、肺、血液的檢出率較高。
（6）雞新城疫病毒強(qiáng)化試驗(yàn) CSFV與NDV在豬睪丸細(xì)胞上均不產(chǎn)生CPE(細(xì)胞致病變效應(yīng))變化。CSFV接種3 d后，再接種NDV，則產(chǎn)生明顯的細(xì)胞病變，而且提高NDV的滴度。根據(jù)細(xì)胞病變的有無(wú)，可間接地測(cè)定CSFV，本試驗(yàn)可作為診斷CSF的方法，稱之為雞新城疫病毒強(qiáng)化試驗(yàn)(Exalting Newcastle Disease, END)。此強(qiáng)化現(xiàn)象可被CSF的抗血清所抑制，同時(shí)也可用于CSFV的中和試驗(yàn)。
      3、血清學(xué)診斷
通常用來(lái)了解豬的群體免疫水平和疫苗免疫效果的評(píng)價(jià)，為預(yù)防接種提供科學(xué)依據(jù)，極少用于單個(gè)病例的診斷。
（1）熒光抗體血清中和試驗(yàn)
用固定量CSFV與不同稀釋度的被檢血清(抗體)在37℃中和1h，而后接種微量培養(yǎng)單層細(xì)胞，進(jìn)行熒光抗體染色，檢查未被抗體中和的殘余病毒，確定血清效價(jià)。血清效價(jià)為與病毒中和后完全抑制病毒熒光斑的最高血清稀釋度。以病毒熒光斑的最高血清稀釋度作為終點(diǎn)為最佳判定。此法敏感、特異，但費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不易推廣。
（2）辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記金黃色葡萄球菌A蛋白酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)
首先將病毒包被在酶聯(lián)反應(yīng)板上4℃過(guò)夜，再將稀釋80倍的被檢血清、陰性血清和陽(yáng)性血清加入各孔，在37℃感作1h，而后依次加入酶標(biāo)抗體、底物液等，用酶標(biāo)儀測(cè)定。疫苗注射豬的血清經(jīng)80倍稀釋后其血清ELISA OD值大于0.3，攻毒100%保護(hù)。OD值大于0.2或大于等于0.3時(shí)，攻毒后75%保護(hù)。OD值小于或等于0.2時(shí)，若為母源抗體，則攻毒不保護(hù)，若為免疫抗體，可有少數(shù)被保護(hù)
（3）免疫酶測(cè)定技術(shù) 1991年，Saunder等報(bào)道了利用酶標(biāo)記抗體微量法檢測(cè)CSF抗體的技術(shù)。 1991年，我國(guó)學(xué)者邱惠深等應(yīng)用淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，研制出CSF單克隆抗體診斷試劑，為我國(guó)的豬瘟特異性診斷開(kāi)了先河。制備的單克隆酶標(biāo)抗體試劑可以區(qū)分疫苗免疫血清、強(qiáng)毒感染血清、混合血清和豬瘟陰性血清。
（4）復(fù)合捕捉封閉ELISA 復(fù)合捕捉封閉ELISA(CTB-ELISA)是檢測(cè)CSF抗體的一種方法，利用兩個(gè)單克隆抗體直接抑制CSFV的不同抗原位點(diǎn)，可鑒別CSF和BVD-MDV。
（5）間接ELISA 1999年，余興龍等建立了檢測(cè)CSF抗體的間接ELISA方法。以在大腸桿菌中高效表達(dá)的CSFVE2主要抗原編碼區(qū)(mE2)基因產(chǎn)物為抗原，以酶標(biāo)記的兔抗豬IgG為二抗，對(duì)待檢血清進(jìn)行檢測(cè)。試驗(yàn)表明用重組mE2蛋白作為診斷CSF的抗原，具有特異性強(qiáng)，易純化，成本低等特點(diǎn)。
（6）競(jìng)爭(zhēng)ELISA 2001年，Clavijo建立了競(jìng)爭(zhēng)ELISA(C-ELISA)方法。將CSFV Alfort/187 E2基因的一部分克隆到大腸桿菌pET表達(dá)載體中，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Ni-NTA純化，制備成單克隆抗體，與待檢血清進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)。此種方法與BVD-MDV血清無(wú)交叉反應(yīng)。
（7） RT-PCP 此技術(shù)是以RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，再以PCR進(jìn)行核酸擴(kuò)增來(lái)檢測(cè)CSFV的方法。這種方法可能成為今后較為理想的檢測(cè)手段之一。
（8）其他血清學(xué)試驗(yàn)尚包括間接血凝試驗(yàn)、瓊脂擴(kuò)散、對(duì)流免疫電泳、斑點(diǎn)ELISA等。

六、
豬瘟疫苗
      1、 CSF滅活疫苗 Dorset等首先研制了豬瘟結(jié)晶紫滅活苗和組織疫苗。1947年，馬聞天等試制過(guò)CSF疫苗。1951~1952年，何正禮等相繼報(bào)道了以不同毒株試制疫苗成功，其中以石門系毒株血毒苗效果最佳。
      2、 CSF弱毒疫苗 1946年，Baker, Koprowski等人報(bào)道用不同方法將不同的CSFV適應(yīng)于家兔，成為對(duì)豬毒力減弱的變異毒株。1954年，我國(guó)成功培育出CSF兔化弱毒株并制備成疫苗(CLS)，又稱“C株”。CSF兔化弱毒株毒力不增強(qiáng)，在豬體內(nèi)連續(xù)傳代后仍保持原弱毒的特性。
      3、低溫細(xì)胞培養(yǎng)CSF弱毒疫苗
（1） GPE株 1959年，Sasahara(日本)選用ALD強(qiáng)毒株，在豬睪丸細(xì)胞上通過(guò)142代，用終點(diǎn)稀釋法選育出純系毒株，先通過(guò)牛睪丸細(xì)胞26代減毒，如上法選擇純系毒株，再經(jīng)適應(yīng)豚鼠腎細(xì)胞傳41代，然后用雞新城疫病毒強(qiáng)化法選出END陰性純系毒株，該毒株能在30℃溫度中增殖。此毒株為弱毒株，可制備弱毒疫苗，無(wú)殘毒，成功的控制了日本的CSF。
（2） Thiverval株 1976年，Aynaud(法國(guó))將強(qiáng)毒Alfort株用 PK15細(xì)胞培養(yǎng)于29℃~30℃連續(xù)傳170代，通過(guò)終點(diǎn)稀釋法選出1株純系弱毒。該毒株對(duì)各種年齡豬均安全有效，免疫原性好，有效地控制了法國(guó)的CSF。
      4、 CSF基因工程疫苗
（1） CSF亞單位疫苗
將編碼某種特定蛋白質(zhì)的基因組，與適當(dāng)質(zhì)?；虿《据d體重組后導(dǎo)入受體(細(xì)菌、酵母或動(dòng)物細(xì)胞)，使其在受體中高效表達(dá)，提取所表達(dá)的特定多肽，加佐劑即制成亞單位疫苗。E2蛋白是CSFV主要保護(hù)性抗原，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，保護(hù)機(jī)體免受強(qiáng)毒的攻擊。因此1993年Flulst, 1993年Bouma, 2000年Tsibezov等分別利用桿狀病毒高效表達(dá)了CSFV E2蛋白亞單位疫苗，分別用20 ug, 32 mg，及200 mg E2蛋白免疫豬，均能完全抵抗致死劑量強(qiáng)毒的攻擊。目前CSFV亞單位疫苗己有商品化產(chǎn)品，但尚存有一定的缺陷。
（2） CSF合成肽疫苗
利用重組DNA技術(shù)根據(jù)病毒基因組的核酸序列，可推導(dǎo)出病毒蛋白質(zhì)的氨基酸序列，從而可用人工合成方法制備病毒主要抗原相應(yīng)的寡肽，制備合成肽疫苗。Dong等報(bào)道合成5段CSF石門株B/C區(qū)693—777位氨基酸，偶聯(lián)BSA制成合成肽疫苗，結(jié)果免疫豬能產(chǎn)生高滴度的抗體，并能完全保護(hù)強(qiáng)毒的攻擊。
（3） CSF活載體疫苗
將外源目的基因用重組DNA技術(shù)克隆到活的載體病毒中制備的一種疫苗，可直接用這種疫苗經(jīng)多種途徑免疫動(dòng)物。目前研究最多的是痘病毒作為載體，其次還有腺病毒、乳多空病毒、口瘡病毒、偽狂犬病毒等。現(xiàn)在這些疫苗尚未達(dá)到實(shí)際應(yīng)用水平。
      5、 CSF標(biāo)記疫苗
（1） CSF亞單位標(biāo)記疫苗實(shí)際上就是CSFV E2, E2B/C區(qū)或E2A區(qū)亞單位疫苗，與亞單位疫苗不同之處，在于同時(shí)建立了相應(yīng)的特種抗原亞單位疫苗，將其接種豬以后能與自然感染CSFV的豬所產(chǎn)生的抗體相區(qū)別，從而達(dá)到區(qū)別人工接種疫苗和自然感染CSFV的診斷方法?，F(xiàn)在所建立的方法多以CSFV E0基因表達(dá)蛋白為抗原制備疫苗，接種豬后機(jī)體不產(chǎn)生抗E0抗體，而自然感染豬則產(chǎn)生特異的E0的抗體，通過(guò)對(duì)特異抗體的鑒別而達(dá)到區(qū)別診斷之目的。1999年，Van Ri jn等在實(shí)驗(yàn)室利用桿狀病毒表達(dá)了CSFV E2 (不包括跨膜區(qū))、E2的A區(qū)及E2的B/C區(qū)制成亞單位標(biāo)記疫苗，結(jié)果均能使免疫豬產(chǎn)生抵抗強(qiáng)毒攻擊的保護(hù)。
（2） CSF C株突變株標(biāo)記疫苗
將CSF兔化弱毒株基因的某一段進(jìn)行人工修飾，即以人為的使其缺失或替換，而其免疫原性不改變，缺失或替換的基因所表達(dá)的蛋白則可作為診斷抗原，從而區(qū)別疫苗接種豬和自然感染豬血清抗體。主要是對(duì)CSF兔化弱毒株進(jìn)行E2或E0基因的部分缺失、全缺失或替換。2000年，Widjojoatmodjo制備了1株E(ms)基因突變株，用其免疫豬能抵抗強(qiáng)毒Brescia株的致死性感染。 2001年，De Smity又構(gòu)建2株C株E2基因突變株。 2002年，Van Gennip等制備了3株C株E2基因突變株。
（3） CSF核酸疫苗
用CSFV E2蛋白基因的表達(dá)載體直接作為抗原免疫動(dòng)物，這種疫苗稱為DNA疫苗，又稱為核酸疫苗。它可誘導(dǎo)體液免疫，又可誘導(dǎo)細(xì)胞免疫。2001年，Markowska-Daniel等報(bào)道CSFV DNA疫苗免疫豬后能完全保護(hù)強(qiáng)毒的攻擊
  七、疫苗選擇與豬瘟免疫程序
經(jīng)過(guò)多年的生產(chǎn)實(shí)踐證明CSF兔化弱毒疫苗在CSF預(yù)防方面起到了較好的效果，但在應(yīng)用上仍存在著許多不合理的問(wèn)題。欲獲得最佳免疫效果，必須解決好以下幾個(gè)方面問(wèn)題：
充分了解各種豬瘟兔化弱毒疫苗特點(diǎn)，合理選擇疫苗：
      1、豬瘟兔化弱毒牛睪丸細(xì)胞疫苗（簡(jiǎn)稱豬瘟細(xì)胞苗）：
優(yōu)點(diǎn)：不容易發(fā)生過(guò)敏反應(yīng)，成本低
缺點(diǎn)：免疫原性稍差，須加大劑量
使用：仔豬的首次免疫，母豬免疫
      2、豬瘟兔化弱毒乳兔組織疫苗（簡(jiǎn)稱豬瘟乳兔組織苗）：
優(yōu)點(diǎn)：免疫原性好，能快速控制疾病，可用于控制慢性豬瘟、非典型豬瘟、溫和型豬瘟
缺點(diǎn)：個(gè)別豬容易發(fā)生過(guò)敏反應(yīng)
使用：豬瘟的加強(qiáng)免疫，豬瘟的緊急免疫接種
   3、豬瘟兔化弱毒成兔脾淋疫苗（簡(jiǎn)稱豬瘟脾淋苗）：
優(yōu)點(diǎn)：抗原性好，免疫后快速產(chǎn)生免疫力；抗原含量高，1 次免疫接種 1 頭份/頭豬；低過(guò)敏，過(guò)敏源含  量極低；能有效控制慢性豬瘟、非典型豬瘟、溫和型豬瘟
缺點(diǎn)：生產(chǎn)成本高
使用：豬瘟的加強(qiáng)免疫，豬瘟的緊急免疫接種
各場(chǎng)可根據(jù)生產(chǎn)實(shí)際情況進(jìn)行疫苗選擇。一般來(lái)說(shuō)，從控制豬瘟的效果和經(jīng)濟(jì)成本考慮，最隹組合是種豬使用豬瘟脾淋疫苗，商品豬首免（或超前免疫）使用牛睪丸細(xì)胞疫苗，二免使用乳兔組織疫苗。
常用的免疫程序有超前免疫、種豬和商品豬免疫。1979年，法國(guó)學(xué)者Ciother等和我國(guó)臺(tái)灣學(xué)者賴秀穗提出了仔豬超前免疫的設(shè)想。即仔豬在出生至吸初乳前進(jìn)行的免疫接種，使其產(chǎn)生主動(dòng)免疫力。這就是所謂的仔豬超前免疫。超前免疫成功的關(guān)鍵在于2個(gè)方面。一是CSF兔化弱毒疫苗免疫接種后吸初乳的時(shí)間的選擇，經(jīng)諸多實(shí)驗(yàn)證明，最佳的吸初乳時(shí)間是免疫接種后60~120 min。 CSF兔化弱毒疫苗抗原在仔豬機(jī)體內(nèi)有效滯留60~120 min，它能與機(jī)體靶細(xì)胞上的CSFV受體相結(jié)合，此時(shí)，CSFV兔化弱毒疫苗抗原可在靶細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制。此種方法能使CSFV兔化弱毒疫苗抗原有效地避免母源抗體的干擾，其免疫效果確實(shí)。二是接種免疫劑量，CSF兔化弱毒細(xì)胞疫苗應(yīng)按現(xiàn)有使用說(shuō)明書(shū)的2頭份劑量使用。用量少時(shí)不足以使機(jī)體產(chǎn)生有效的免疫力，用量過(guò)大時(shí)易造成免疫麻痹。超前免疫的仔豬45~50日齡進(jìn)行第2次免疫。
種豬免疫一般是在仔豬斷奶前后，對(duì)母豬作一次免疫或種豬集中統(tǒng)一在一年內(nèi)作3-4次免疫。商品豬免疫在仔豬20-30日齡進(jìn)行首免，50-60日進(jìn)行二免。

八、疫苗研究展望
      1、研制使用CSF高效濃縮疫苗
歐洲藥典規(guī)定用C株疫苗免疫時(shí)，肌注劑量為100PD50(400RID)。我國(guó)規(guī)定劑量為150 RID，折算為37 PD50。顯然，我們現(xiàn)行的使用劑量低于國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)。因此，有必要研制使用CSF高效濃縮疫苗，為CSF的免疫預(yù)防提供強(qiáng)有力的物質(zhì)保障。
      2、研究開(kāi)發(fā)新型疫苗
研究制備特異性強(qiáng)、免疫原性好的基因工程疫苗，以便在生產(chǎn)實(shí)踐中更有效地區(qū)別人工接種疫苗與自然感染豬只，為CSF的凈化提供必要的技術(shù)手段。