覃川杰(3) 徐 鎮(zhèn)(1) 肖志猛(1) 陳昌福(1，2)
(1)華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，武漢 430070；
(2)華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070
陳昌福 教授電話:027-87286037 chenchangfu@mail.hzau.edu.cn 摘要 本文報(bào)道HB-101壯健極品對(duì)中華鱉(Pelodiscus sinensis)幼鱉非特異性免疫功能和抗病力影響的研究結(jié)果。試驗(yàn)共設(shè)6個(gè)組，在各組餌料中HB-101壯健極品的添加量依次為0 mg/kg(對(duì)照組)、10.0 mg/kg.B.W.(試驗(yàn)I組)、20.0 mg/kg.B.W.(試驗(yàn)Ⅱ)、30.0 mg/kg.B.W.(試驗(yàn)Ⅲ組)、40.0 mg/kg.B.W.(試驗(yàn)Ⅳ組)和50.0 mg/kg.B.W.(試驗(yàn)V組)。投喂30 d后，從每組中各取10只中華鱉幼鱉采血，測(cè)定了中華鱉幼鱉血液中白細(xì)胞的吞噬活性、血清中溶菌酶和補(bǔ)體活性；另從每組分別取30只中華鱉幼鱉用注射嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)的方法行人工感染，檢測(cè)其抗病力。研究結(jié)果表明，各試驗(yàn)組中華鱉幼鱉血液中白細(xì)胞的吞噬活性均顯著高于對(duì)照組(t測(cè)驗(yàn)，P<0.05)。第Ⅰ和第Ⅱ組中華鱉幼鱉血清中溶菌酶活性與對(duì)照組之間沒有顯著性差異(t測(cè)驗(yàn)，P>0.05)，而試驗(yàn)Ⅲ、Ⅳ組和Ⅴ組中華鱉幼鱉血清中溶菌酶活性均顯著高于對(duì)照組(t測(cè)驗(yàn)，P<0.05)。第Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和第Ⅴ組中華鱉幼鱉血清中補(bǔ)體活性與對(duì)照組之間存在顯著差異(t測(cè)驗(yàn)，P<0.05)，而第Ⅰ組與對(duì)照組之間無顯著性差異(t測(cè)驗(yàn)，P>0.05)。投喂HB-101能增強(qiáng)中華鱉幼鱉對(duì)人工感染A. hydrophila活菌的抵抗力。研究結(jié)果證明在中華鱉幼鱉餌料中添加HB-101的量以20.0 mg/kg.B.W.左右為宜。
關(guān)鍵詞 中華鱉幼鱉；HB-101壯健極品；溶菌酶；補(bǔ)體；抗病力；嗜水氣單胞菌 作者等的初步研究結(jié)果已經(jīng)證實(shí)，對(duì)中華鱉(Pelodiscus sinensis)投喂適量的HB-101壯健極品能增強(qiáng)其非特異性免疫功能[1]，說明HB-101壯健極品具有免疫刺激劑(immunostimulant)的特性，而且中華鱉的免疫系統(tǒng)同其它水產(chǎn)動(dòng)物一樣能被免疫刺激劑激活[2~9]。但是，關(guān)于HB-101壯健極品所誘導(dǎo)的中華鱉非特異性免疫機(jī)能對(duì)其抗病力有無影響，尚不清楚。Robertsen等將從酵母菌中提取的β-葡聚糖給予大西洋鮭(Salmon salar)后，活菌攻毒結(jié)果證明供試魚對(duì)滅鮭氣單胞菌(Aeromonas salmonicida)、鰻弧菌(Vibrio anguillarum)和魯克耶爾森菌(Yersinia ruckeri)等致病菌感染的抵抗力顯著增強(qiáng)[4]。Anderson等用注射和浸泡法對(duì)溪紅點(diǎn)鱒(Salvelinus fontinalus)給予β-葡聚糖后，試驗(yàn)魚對(duì)人工感染A. salmonicida 活菌的抵抗力也顯著增強(qiáng)[5]。Brattgjerd等對(duì)大西洋鮭注射酵母葡聚糖后，雖然發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)魚的巨噬細(xì)胞在離體條件下的吞噬活性和產(chǎn)生H2O2量有所上升，但是，攻毒試驗(yàn)結(jié)果卻表明試驗(yàn)和對(duì)照組魚體之間抗感染力沒有顯著差異[6]。Jeney等將葡聚糖作為佐劑與A.salmonicida滅活菌苗聯(lián)合使用，結(jié)果只是證明了能顯著提高供試虹鱒(Oncorhynchus mykiss)的部分非特異性免疫指標(biāo)，而未對(duì)供試魚進(jìn)行抗病力的測(cè)定[7]。
本研究利用武漢泰富產(chǎn)業(yè)有限公司生產(chǎn)的HB-101健壯極品定量投喂中華鱉幼鱉后，在測(cè)定幾種非特異性免疫指標(biāo)變化的基礎(chǔ)上，采用活菌攻毒的方法檢測(cè)了供試中華鱉幼鱉的抗病力，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。 1 材料和方法 1.1 供試中華鱉幼鱉和飼養(yǎng)條件
本研究中的中華鱉幼鱉飼養(yǎng)試驗(yàn)在武漢多福科技農(nóng)莊股份有限公司梁子湖特種水產(chǎn)苗種基地越冬溫室內(nèi)飼養(yǎng)池中進(jìn)行。在每個(gè)24.0 M2的水泥飼養(yǎng)池內(nèi)飼養(yǎng)有平均體重63.0 g左右的600~650只中華鱉幼鱉，溫室內(nèi)溫度變化在24℃~33℃之間，光照為人工光照和自然光照。每天上午9:00和下午6:00各投喂1次餌料，將餌料加少量水合成面團(tuán)后投喂，投餌量以使中華鱉幼鱉達(dá)到飽食并有少量剩余為準(zhǔn)。投餌4 h后，取出剩余餌料。所用餌料為武漢高龍餌料有限公司生產(chǎn)的全價(jià)幼鱉餌料，對(duì)照組所用餌料中除沒有添加HB-101之外，其它營(yíng)養(yǎng)成分均沒有改變。 1.2 HB-101壯健極品
用于本研究的HB-101壯健極品是泰富生命工程(武漢)有限公司生產(chǎn)的粉劑。 1.3試驗(yàn)設(shè)計(jì)
在全60個(gè)同規(guī)格的飼養(yǎng)池中隨機(jī)選取6個(gè)條件相同的飼養(yǎng)池作為試驗(yàn)池。將試驗(yàn)中華鱉幼鱉隨機(jī)分成6組。由于中華鱉幼鱉外觀上難以區(qū)分雌雄，因此，在本研究中不區(qū)分試驗(yàn)中華鱉幼鱉的性別。各組餌料中HB-101壯健極品的添加量分別為0 mg/kg(對(duì)照組)、10.0 mg/kg.B.W.(試驗(yàn)I組)、20.0 mg/kg.B.W.(試驗(yàn)Ⅱ組)、30.0 mg/kg.B.W.(試驗(yàn)Ⅲ組)、40.0 mg/kg.B.W.(試驗(yàn)Ⅳ組)和50.0 mg/kg.B.W.(試驗(yàn)Ⅴ組)。制作的餌料存放在陰涼處，每天喂食前4 h配制餌料。連續(xù)投喂30 d。 1.4 采血
在預(yù)定連續(xù)投喂30 d結(jié)束后的第2 d，從每個(gè)試驗(yàn)和對(duì)照池中隨機(jī)撈取10只中華鱉幼鱉以斷頭法采血，將每只鱉的血液分為2份，其中1份以肝素抗凝，制備抗凝血供測(cè)定吞噬細(xì)胞的吞噬活性用；另1份血液置于4℃條件下離心制備血清，血清保存在-20℃冰箱中，以備下列指標(biāo)的測(cè)定。 1.5解剖觀察及臟器測(cè)量
對(duì)采血后的中華鱉幼鱉進(jìn)行解剖，肉眼觀察試驗(yàn)與對(duì)照組中華鱉幼鱉臟器的異同，并對(duì)分離的器官和組織分別稱重和測(cè)量，用以比較試驗(yàn)與對(duì)照組中華鱉幼鱉的機(jī)體指標(biāo)(簡(jiǎn)稱“體指”)異同。 1.6 吞噬原的制備
將金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)接種在液體肉湯培養(yǎng)基中，37℃下培養(yǎng)48 h后，離心集菌，在菌液中加入濃度為0.5%的福爾馬林，37℃下滅活24 h，用滅菌生理鹽水清洗3次，并將其濃度調(diào)整至1.0×108cells/mL，即為福爾馬林滅活的S. aureus菌體(formalin killed S.aureus, F-SA)，用作檢測(cè)血細(xì)胞吞噬活性的吞噬原。 1.7 血細(xì)胞吞噬活性的測(cè)定
在0.3 mL抗凝血中加入0.2 mL F-SA，搖勻，在25℃的恒溫水浴鍋中孵育45 min，每隔10 min搖動(dòng)1次。用吸管吸取血細(xì)胞涂片，每個(gè)樣品涂5張，用甲醇固定10 min，Giemsa染色液染1 h，水洗風(fēng)干后，鏡檢，并依下式計(jì)算白細(xì)胞吞噬百分比(phagocytic percentage，PP)和吞噬指數(shù)(phagocytic index，PI)。
吞噬百分比(PP) =(100個(gè)吞噬細(xì)胞中參與吞噬的細(xì)胞數(shù)/100)×100
吞噬指數(shù)(PI )= 細(xì)胞內(nèi)總菌數(shù)/參與吞噬的細(xì)胞數(shù) 1.8 血清溶菌酶活性的測(cè)定
以溶壁微球菌(Micrococcus lysoleikticus)凍干粉為底物，將底物用0.1mol/L的pH為6.4的磷酸鉀鹽緩沖液配成一定濃度的懸液(O.D.570≈0.35~0.5)。取3.0 mL該懸液與0.05mL待測(cè)血清于試管中混勻，測(cè)其在570 nm處的光密度值(A0)，然后置于37℃水浴保溫30 min，取出后立刻置于冰浴中10.0 min以終止反應(yīng)，測(cè)其在570 nm處的光密度值(A)。溶菌活力按下式計(jì)算：Uk=[(A0-A)/A]1/2 1.9 血清補(bǔ)體C3和C4活性的測(cè)定
采用伊利康生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的試劑盒，分別要求加入各試劑及血清后，在37℃水浴10 min，用透射比濁法在722型紫外分光光度計(jì)340 nm波長(zhǎng)處讀取測(cè)定管和標(biāo)準(zhǔn)管的光密度值(A)，以計(jì)算補(bǔ)體C3和C4的活性。 1.10 抗病力檢測(cè)
將從患病中華鱉上分離的嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)BS-1菌株[10]接種在BHI(Difco)培養(yǎng)基中，28℃條件下培養(yǎng)36 h后，離心法集菌并以除菌生理鹽水調(diào)節(jié)菌液濃度至2.3×107cfu/mL備用。從各試驗(yàn)和對(duì)照組中分別隨機(jī)撈取30只中華鱉幼鱉，經(jīng)后肢窩對(duì)每只中華鱉幼鱉注射0.4 mL的A.hydrophila活菌液后，繼續(xù)飼養(yǎng)觀察21 d。對(duì)死亡的中華鱉幼鱉進(jìn)行解剖并分離致病菌，以鼠抗A.hydrophila菌株血清與分離所得致病菌進(jìn)行玻片凝集試驗(yàn)，判斷是否由A.hydrophila感染致死。統(tǒng)計(jì)各組的死亡率，依下式計(jì)算相對(duì)保護(hù)率(Relative percent survival，RPS)。
相對(duì)保護(hù)率(RPS)= [1-(免疫組死亡率/對(duì)照組死亡率)]×100% 2 結(jié)果 2.1 HB-101健壯極品對(duì)中華鱉幼鱉各項(xiàng)體指的影響
對(duì)試驗(yàn)和對(duì)照中華鱉幼鱉體重與各項(xiàng)體指的測(cè)量結(jié)果如表1所示。試驗(yàn)期間對(duì)照和試驗(yàn)組 表1 對(duì)照和試驗(yàn)中華鱉幼鱉的增重量1)
Table 1 Growth of control and experimental juvenile soft-shelled turtle(Pelodiscus sinensis)
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1)10只供試中華鱉幼鱉的平均值，Mean value of 10 experimental juvenile soft-shelled turtle 中華鱉幼鱉的增重量、體重與內(nèi)臟比和內(nèi)臟與肝臟比，均無顯著性差異(t測(cè)驗(yàn)，P>0.05)。此外，經(jīng)過肉眼觀察，對(duì)照與試驗(yàn)組中華鱉幼鱉的體形、內(nèi)臟形態(tài)與顏色均未出現(xiàn)明顯差別。表明各種劑量的HB-101健壯極品，對(duì)中華鱉幼鱉的生長(zhǎng)和機(jī)體各組織器官的正常生理機(jī)能沒有明顯不良影響。
2.2 白細(xì)胞吞噬活性的變化
供試中華鱉幼鱉血液中白細(xì)胞的PP和PI測(cè)定結(jié)果如表2所示。由表2可以看出投喂HB-101壯健極品的中華鱉血液中白細(xì)胞的PP和PI均高于對(duì)照組，PP和PI最高的是HB-101健壯極品投喂量為40.0 mg/kg.B.W.的第Ⅳ組。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，試驗(yàn)組中華鱉幼鱉血液中白細(xì)胞的PP和PI均顯著高于對(duì)照組(t測(cè)驗(yàn)，P<0.05)，而各試驗(yàn)組之間沒有顯著性差別(t測(cè)驗(yàn)，P>0.05)。 表1 供試中華鱉幼鱉血液中白細(xì)胞的吞噬活性
Table 2 Phagocytic activity of leucocytes in the blood of juvenile soft-shelled turtle(Pelodiscus sinensis)
組別 吞噬活性 Phagocytic activity
Groups PP PI
Ⅰ 51.2±5.6 4.37±0.46
Ⅱ 48.5±6.1 4.69±0.53
Ⅲ 49.7±5.9 4.54±0.63
Ⅳ 50.4±4.8 5.03±0.66
Ⅴ 48.6±5.3 5.12±0.74
對(duì)照 Control 38.8±4.9 3.59±0.52 2.3 溶菌酶和補(bǔ)體活性的變化
供試中華鱉幼鱉血清中溶菌酶與補(bǔ)體活性的測(cè)定結(jié)果如表3所示。由表3可以看出投喂HB-101壯健極品的試驗(yàn)組中華鱉幼鱉血清中的溶菌酶活性均高于對(duì)照組，溶菌酶活性最高的是HB-101壯健極品投喂量為40.0 mg/kg.B.W.的第Ⅵ組，其次是第Ⅴ組。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，第Ⅲ組、第Ⅵ組和第Ⅴ組中華鱉幼鱉血清中溶菌酶活性與對(duì)照組之間存在顯著性差異(t測(cè)驗(yàn)，P<0.05)；而第Ⅰ組和第Ⅱ組與對(duì)照組之間沒有顯著性差異(t測(cè)驗(yàn)，P>0.05)。
供試中華鱉幼鱉血清中補(bǔ)體C3和C4的活性測(cè)定結(jié)果表明，投喂HB-101壯健極品的中華鱉幼鱉血清中補(bǔ)體C3活性均高于對(duì)照組，補(bǔ)體C3和C4活性最高的是投喂量為50.0 mg/kg.B.W.的第Ⅴ組，其次是投喂量為120.0mg/kg.B.W.的第Ⅳ組。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，第Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和第Ⅴ組中華鱉幼鱉血清中補(bǔ)體活性與對(duì)照組之間存在顯著差異(t測(cè)驗(yàn)，P<0.05)，而第Ⅰ組與對(duì)照組之間無顯著性差異(t測(cè)驗(yàn)，P>0.05)。 表3 供試中華鱉幼鱉血清中溶菌酶和補(bǔ)體C3、C4的活性
Table 3 Lysozyme and complement activity in the serum of juvenile soft-shelled turtle(Pelodiscus sinensis)
組別 溶菌酶 補(bǔ)體活性 Complement activity
Groups Lysozyme C3 C4
Ⅰ 0.206±0.044 0.283±0.062 0.299±0.065
Ⅱ 0.228±0.056 0.312±0.057 0.314±0.065
Ⅲ 0.322±0.064 0.335±0.062 0.348±0.053
Ⅳ 0.365±0.042 0.372±0.051 0.366±0.072
Ⅴ 0.366±0.054 0.379±0.081 0.372±0.049
對(duì)照 Control 0.204±0.037 0.279±0.067 0.293±0.039
2.4 人工接種致病菌后中華鱉幼鱉的存活率
對(duì)照和試驗(yàn)組中華鱉幼鱉經(jīng)活菌人工感染后，各組的死亡情況如表4所示。從表4 可以看
表4 活菌攻毒后中華鱉幼鱉的死亡率和相對(duì)保護(hù)率
Table 4 Mortality and relative percent survival(RPS)of juvenile soft-shelled turtle(Pelodiscus sinensis)，after challenged with live Aeromonas hydrophila
組別 攻毒鱉只數(shù) 死亡鱉只數(shù) 死亡率 相對(duì)保護(hù)率
Number of fish Number of dead Mortality Relative percent
Groups Challenged Fish % Survival(RPS)%
Ⅰ 30 11 36.7 60.6
Ⅱ 30 10 33.3 64.3
Ⅲ 30 7 23.3 75.0
Ⅳ 30 8 26.7 71.4
Ⅴ 30 6 20.0 78.6
對(duì)照 Control 30 28 93.3 出經(jīng)過投喂HB-101壯健極品1的中華鱉幼鱉均獲得了比較高的RPS，而在餌料中添加HB-101健壯極品 30.0 mg/kg.B.W.以上的第Ⅲ、第Ⅳ和第Ⅴ組中華鱉幼鱉死亡率明顯的低于添加量為10.0 mg/kg.B.W.和20.0 mg/kg.B.W.的第Ⅰ和第Ⅱ組。 3 討論
與其他動(dòng)物一樣，中華鱉的非特異性免疫功能也包括體液免疫和細(xì)胞免疫部分[11]。在水產(chǎn)動(dòng)物的細(xì)胞免疫中，血液中的白細(xì)胞的作用又是至關(guān)重要的[12]。魚類的嗜中性白細(xì)胞和單核細(xì)胞已經(jīng)被證明具有很強(qiáng)的吞噬能力，這種能力對(duì)于特異性免疫機(jī)能相對(duì)于高等脊椎動(dòng)物比較低等的動(dòng)物而言，具有更為重要的意義[13]。白細(xì)胞的吞噬功能是動(dòng)物非特異性免疫的重要組成部分。因此，通過測(cè)定血液中白細(xì)胞的吞噬功能，可以反映機(jī)體的非特異性細(xì)胞免疫狀態(tài)[14]。有研究結(jié)果證明了大西洋鮭的巨噬細(xì)胞上存在β-葡聚糖受體(receptor)，因此可以接受β-葡聚糖的刺激而增強(qiáng)其細(xì)胞的吞噬活性[15]。本研究的結(jié)果證明，在中華鱉幼鱉的餌料中添加HB-101壯健極品，能有效地增強(qiáng)白細(xì)胞的吞噬活性，說明這種物質(zhì)對(duì)中華鱉幼鱉的免疫系統(tǒng)具有刺激作用。然而，關(guān)于這種物質(zhì)究竟是作用于中華鱉幼鱉的何種免疫細(xì)胞而啟動(dòng)細(xì)胞免疫過程的，尚有待進(jìn)行更為深入的研究。
溶菌酶的活性是決定吞噬細(xì)胞對(duì)所吞噬的致病菌能否被殺滅的物質(zhì)基礎(chǔ)之一[12]。因此，測(cè)定動(dòng)物的溶菌酶活性，在一定程度上能反映動(dòng)物非特異性體液免疫狀態(tài)。魚類血清中的溶菌酶活性可以因機(jī)體接觸抗原性物質(zhì)或者受到環(huán)境因子的刺激而上升[12，16]。本研究結(jié)果證明了在中華鱉幼鱉餌料中添加HB-101能提高其血清中溶菌酶的活性，而且在10.0mg/kg.B.W.至50.0 mg/kg.B.W.的添加量范圍內(nèi)，隨著HB-101健壯極品添加量的提高，供試中華鱉幼鱉血清中溶菌酶的活性也逐漸提高。由于本研究中采用的最高添加量為50.0 mg/kg.B.W.，所以，更高用量的HB-101健壯極品對(duì)中華鱉幼鱉的免疫機(jī)能是否也有抑制作用，值得進(jìn)一步研究。
動(dòng)物體內(nèi)的補(bǔ)體主要是由肝細(xì)胞和巨噬細(xì)胞合成的，而血清中的補(bǔ)體主要是來自肝細(xì)胞[14]。本研究結(jié)果表明投喂HB-101健壯極品可以增強(qiáng)中華鱉幼鱉血清中補(bǔ)體C3和C4的活性，試驗(yàn)組中華鱉幼鱉血清中補(bǔ)體C3和C4的活性均高于對(duì)照組。用A. hydrophila活菌對(duì)試驗(yàn)和對(duì)照組中華鱉幼鱉人工感染試驗(yàn)結(jié)果表明，口服給予HB-101健壯極品能提高中華鱉幼鱉對(duì)A. hydrophila活菌感染的RPS，并且其RPS的變化趨勢(shì)與中華鱉幼鱉血液中白細(xì)胞的吞噬活性、血清中溶菌酶、補(bǔ)體活性上升趨勢(shì)相一致，這種結(jié)果表明檢測(cè)中華鱉幼鱉血液中白細(xì)胞的吞噬活性、血清中溶菌酶、補(bǔ)體活性等指標(biāo)，可以反映中華鱉幼鱉機(jī)體抗病力的狀況。
綜上所述，投喂適量的HB-101壯健極品對(duì)中華鱉幼鱉的非特異性免疫功能有明顯的促進(jìn)作用，并且對(duì)中華鱉幼鱉的生長(zhǎng)、機(jī)體形態(tài)和顏色均沒有不良影響。說明在餌料中添加適量的HB-101健壯極品能達(dá)到增強(qiáng)中華鱉幼鱉抗病力、預(yù)防傳染性疾病發(fā)生的效果。 參考文獻(xiàn) 1 陳昌福，姚 鵑，吳 凡等. 免疫多糖(酵母細(xì)胞壁)對(duì)中華鱉非特異性免疫功能的影響. 水生生物學(xué)報(bào)，2004，28(6)：
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(1) Fishery College of Huazhong Agricultural University, Wuhan, 430070；
2)State Key Laboratory of Agricultural Microbiology of of Huazhong Agricultural University, 430070) Abstract The effect of the dietary HB-101 non-specific immune function and disease resistance in juvenile soft-shelled turtle (Pelodiscus sinensis) was studied. The turtles were divided into 6 groups and were fed with feed supplemented with different ratio of HB-101, that was 0 mg/kg(control group)、10.0 mg/kg.B.W.(group I)、20.0 mg/kg.B.W.(group Ⅱ)、30.0 mg/kg.B.W.(group Ⅲ)、40.0 mg/kg.B.W.(group Ⅳ)and 50.0 mg/kg.B.W.(group Ⅴ), respectively. 30 days later, the turtles were blooded, and the phagocytic activity of the leucocytes, serum lysozyme activity, complement activity and disease resistance were monitored. The results showed that the phagocytic activity of the leucocytes were significantly higher than the control group (t-test, p<0.05).The lysozyme activity of the serum in group Ⅲ, Ⅳ and Ⅴ were significantly higher than the control group (t-test, p<0.05). However, there were no significant differences among group Ⅰ, Ⅱ and the control group (t-test, p>0.05). The highest complement activity of the serum in group Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ and Ⅴ were significantly higher than the control group (t-test, p<0.05), which were no significant differences between group Ⅰ and control group (t-test, p>0.05). The results demonstrate that the best supplementation ratio of the activite yeast cell in the soft-shelled turtle is about 20.0 mg/kg. B.W.
Keywods juvenile soft-shelled turtle, HB-101, lysozyme, complement, disease resistence, Aeromonas hydrophila | 
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發(fā)表于 2007-12-8 09:21:20
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