豬傳染病的準確診斷——尋找從臨床到實驗室的銜接

dragonli97 · 發(fā)表于 2008-1-18 02:19:55

豬傳染病的準確診斷——尋找從臨床到實驗室的銜接

李龍* 浙江大學動物預防醫(yī)學研究所, 杭州，310029

章葉恩上海諾華動物保健有限公司，上海，200031

* 現(xiàn)工作地址：Department of molecular microbiology and immunology, University of Missouri-Columbia, MO, 65203, USA

E-mail: dragonli97@hotmail.com或lilo@missouri.edu

多病原的混合感染已經(jīng)成為當前豬傳染性疾病流行的最主要特征之一，導致發(fā)病率和死亡率的顯著上升，帶來巨大的經(jīng)濟損失，同時造成了病豬臨床癥狀的不典型，為診斷帶來了很大的難度，臨床上，我門已經(jīng)很難簡單地將幾個癥狀組合起來就判定是什么疾病。例如與PRDC相關的病原包括PRRSV、肺炎支原體（Mh）、PCV-2、CSFV、鏈球菌、副豬嗜血桿菌、豬放線桿菌、巴氏桿菌等等，上述兩種以上的病原混合感染時，造成的損失大大加劇。因此在具有豐富臨床經(jīng)驗的獸醫(yī)指導下，尋找有效的疾病控制措施的同時，很多時候我們需要對疾病進行實驗室確診。如何銜接從臨床到實驗室的過程，就顯得十分重要。經(jīng)驗豐富的獸醫(yī)在診斷疾病的同時，能夠按照幾個大類對可能感染的病原進行分類，然后針對性的采集、保存和送檢病料。然而臨床上，往往由于病料的選擇、采集方法、儲存和運輸方式不正確，大致最后送到實驗室的樣本無法進行檢測，或導致檢測結果不準確，最后延誤了疾病的診斷，甚至造成誤診。本文就上述工作展開幾個原則性的討論，為臨床病料的收集和運輸，提供一些有實際意義的建議。

一、臨床診斷
這個環(huán)節(jié)需要經(jīng)驗豐富的獸醫(yī)來做出對疾病的初步診斷，對臨床癥狀十分典型的病例果斷地采取措施。然而，多病原的混合感染已經(jīng)十分普遍，僅憑臨床表現(xiàn)有時很難對疾病進行準確診斷。因此更為有意義的臨床診斷是在上述基礎上，對可能感染的幾種病原體進行一個指向，特別是分類細菌性、病毒性和寄生蟲性的感染，在及時采取措施的前提下，來提示進一步的實驗室診斷；另外，臨床經(jīng)驗并不豐富的實驗室人員一般很難直接從送檢的病料特征上判斷可能的疾病，特別是為了運輸方便，只是采集了部分臟器的病料。因此臨床獸醫(yī)與實驗室人員的良好溝通、針對性地采集病料和送檢，對實驗室的診斷有很大的幫助。
二、 實驗室診斷
1、寄生蟲的診斷
對寄生蟲的實驗室診斷相對容易，通常情況下，直接制備涂片、觸片、或者網(wǎng)篩富集后制備涂片、有時輔助以染色，通過顯微鏡觀察蟲體就可以作出診斷。當然，臨床診斷的指向作用的意義十分重要，一個最簡單的例子，區(qū)分可能是血液還是腸道感染了寄生蟲，是開始制備檢查材料的前提。當然也不排除其他的一些復雜情況。分子生物學方法（如PCR）也在很多寄生蟲疾病的診斷中發(fā)揮了很好的作用，如弓形蟲的診斷。
2、細菌分離鑒定
在進行細菌分離鑒定時，臨床診斷的指向作用就顯得意義重大了。因為不同的細菌對培養(yǎng)環(huán)境、營養(yǎng)需求是有很大差別的。比如只是為了鑒別診斷大腸桿菌和沙門氏菌，那么普通的麥康凱培養(yǎng)基就可以了；但是如果是懷疑是鏈球菌則需要血平板來培養(yǎng)；如果懷疑是副豬嗜血桿菌或豬放線桿菌，最好采用巧克力平板來分離，針對某些血清型，甚至需要加入NAD?？傊煌募毦呐囵B(yǎng)條件差異很大?？紤]到實驗條件和成本、在針對同一份病料進行細菌分離鑒定時，一般不會同時使用很多種培養(yǎng)基。因此，如果臨床診斷的指向性不強或出現(xiàn)偏差，往往會導致實驗室細菌分離的失敗，無法繼續(xù)診斷程序。
3、血清學和病毒檢測
目前對多種病毒性病原的血清學診斷方法已經(jīng)相對成熟，包括PRRSV、PRV、CSFV、PCV-2等等，其中以PRV的鑒別診斷最為理想。但是通常情況下，由于缺乏對流行病學和疫苗免疫背景的清晰調(diào)查，血清學診斷結果的指導作用往往會打折扣。因此強指向性的臨床診斷結果會大大有助于實驗室結果的分析和確診。同樣的開展病原學的診斷可以極大程度地提高實驗室診斷的準確性。如針對CSFV的抗原捕獲ELISA和PCR、針對PRV gE或gD基因設計的鑒別診斷PCR、針對PRRSV的熒光定量PCR等等。同樣的進行病原學診斷的前提是獲得流行病學和疫苗免疫的背景資料，例如，剛剛免疫了CSFV，就采集扁桃體進行PCR檢測CSFV，顯然是不合適的。

三、 病料的采集
在整個疾病的診斷過程中，病料采集可以說是最簡單的一個步驟，但又是銜接臨床與實驗室的關鍵步驟，如果沒有一個指向性的臨床診斷和基微生物學知識基礎，很多時候會犯一些小錯誤。
1、寄生蟲和細菌性疾病的病料采集和運送
一個強烈的建議：針對寄生蟲和細菌分離鑒定的病料，只要條件允許最好直接送檢活豬。當然如果條件不允許，也要送檢完整的臟器系統(tǒng)，如整個的肝臟、整個的心臟、整個的脾臟，上述條件對保證樣品在送檢過程中不被污染是至關重要。送檢的動物或者用于采集病料的動物，最好在送檢前1周，停止使用所有抗寄生蟲藥物和抗生素，這樣能夠讓關鍵的致病寄生蟲或者細菌得以大量繁殖，有利于下一步的病原分離。同樣的，選取的送檢動物最好是那些將死未死的發(fā)病動物，原因同上。
一個必須滿足的條件：上述用途的病料一定要新鮮?。。∷^新鮮，一個簡單的解釋就是不能冷凍和腐敗。如果將病料冷凍處理，由于細胞內(nèi)形成冰晶，細胞膜被刺破，在下次解凍時，寄生蟲和細菌就死亡了，進一步的分離也就中斷了。如果是腐敗的病料，那么病料中含有的最多的細菌就不是疾病相關的了，而是腐敗相關的細菌，這顯然會大大影響分離的結果。那么如何在運送過程中保證病料的新鮮呢？這對于活體運送，沒有問題。但是運送臟器病料就需要采取一些必要的措施，一個簡單的方法是，將病料按不同臟器或者不同動物的所有臟器，以保鮮袋分開包裝編號后，置于泡沫保溫箱中，然后放入足夠的冰塊（礦泉水瓶灌水冷凍即可），保證整個運送過程中病料處于新鮮狀態(tài)。
在完成了上述步驟后，就是實驗室的工作的了。在這里只是簡單地描述一下。寄生蟲的分離和觀察，比較簡單，但是需要豐富的經(jīng)驗。細菌的分離相對復雜，特別是往往一次能從病料中分離到很多種細菌和霉菌，甚至長了滿滿的一個平板，如何從這些菌落中挑出與疾病密切相關的菌落，然后針對性地進行生化試驗，并非易事，這需要扎實的理論功底、豐富的實驗技能和臨床經(jīng)驗，當然先進的自動細菌測定系統(tǒng)，大大簡化了上述步驟。
當然，如果是采用諸如PCR的方法來診斷，冷凍病料也同樣可以使用，但是往往結果不理想。采用純化后的細菌制備模板，進行PCR診斷，更容易得到準確的結果。另外，純化的細菌可以進行進一步的藥敏試驗，指導臨床用藥。
2、病毒性疾病的病料采集和運送
因為病毒并不會因為有限次的凍融而死亡，因此可以冷凍的方式運送病料，這幾乎不影響病毒的分離和檢測。用于病毒性病原的診斷方法有很多，如間接免疫熒光試驗、瓊脂擴散試驗、基因探針、聚合酶鏈式反應（PCR）等等。對于常規(guī)的一些病毒病原，PCR方法已經(jīng)十分成熟，大多數(shù)的實驗室也是采用這種方法進行檢測的，從這個意義上講，冷凍病料對于病毒病原的診斷沒有任何影響，同時，因為用于這樣運送的病料在采集時并不在乎細菌的污染，采集程序比較簡單，只要切取相應的臟器組織的一部分就可以了。當然對于不同的病原，采集的臟器是不同的。淋巴結和其他免疫器官，通常是病料采集的首選器官。如檢測CSFV最好采用扁桃體，檢測PRRSV采用肺門淋巴結會好一些。這里需要指出的是，對于很對引起流產(chǎn)的病毒，我們很容易想到直接送檢流產(chǎn)胎兒，但是很多時候這個選擇并不理想，如PRRSV的檢測，在實驗中，我們就曾有多次不能從流產(chǎn)胎兒中檢測到PRRSV，而可以從流產(chǎn)母豬體內(nèi)檢測到的例子。
3、血清學樣品的采集和運送
抽血的方法，每個豬場都有自己的一套，總的只要把握一個原則，采集的血液盡量不受污染。其實用于檢測的血清量并不需要太多，大約1ml血液析出的血清已經(jīng)足夠。一個建議是，用一次性注射器采血，采集了大約1ml后，稍稍抽出滑塞，然后套回針頭套，室溫下呈30度傾斜放置，待血液凝集后運送，最好在24小時內(nèi)送達檢測單位。有條件的豬場，也可以自己分離血清后保存或送檢。

總之，強指向性的臨床診斷和針對性的實驗室檢查的結合，可以大大幫助疾病的診斷和控制。以合適的方法，采集合適的病料，并以正確的方法運送，是實現(xiàn)正確診斷的必要條件。