（福建農(nóng)林大學動物科學學院，福建 福州 350002）
關鍵詞：大腸桿菌； Kirby－Bauer法；耐藥性；流行病學
Study on the epidemiology of E.coli resistance in pig farms YU Dao-jin, HUANG Yi-fan, DENG Wen-hua, FANG Xue-yan (Collge of animal science, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China)
by using the Kirby-Bauer method recommended by NCCLS. The result indicated that there is little differences between the two pig farms， though there are many differences in the using of antibiotic. It is prompted that there are some disciplinarians in the form of antibiotic resistance. To some antibiotic, once resistance has been formed, it is difficult for them to resume. There is directly relationship between the using frequency and the appearance of multi-resistant bacterium.
Key words: E.coli；Kirby-Bauer method；antibiotic resistance；epidemiology
細菌對養(yǎng)殖場常用抗生素產(chǎn)生耐藥性已經(jīng)引起普遍的關注，其中大腸桿菌的耐藥性研究較為集中也較為深入。目前研究多集中在對耐藥性進行一定范圍的調(diào)查和運用分子生物學手段進行耐藥機理的研究，而對細菌耐藥性的流行病學研究較少[1-3]。本研究對用藥習慣和用藥頻率存在較大差異的新舊兩個豬場分離到的大腸桿菌進行了17種抗菌藥物的敏感性測試，以期尋求細菌耐藥性形成的一些規(guī)律，為減少耐藥細菌的出現(xiàn)和指導臨床合理用藥提供理論依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1
菌株
2004年4月，在福建省福清市兩個有代表性的規(guī)?；?a href="http://m.ffers.com.cn/pigs/" target="_blank" class="relatedlink">養(yǎng)豬場，分離到大腸桿菌共計142株。
1.1.2
培養(yǎng)基
麥康凱瓊脂、水解酪蛋白瓊脂、營養(yǎng)肉湯等購自上海伊華醫(yī)學科技有限公司。
1.1.3
藥敏紙片
按照FDA認可的臨床微生物實驗室非嬌嫩細菌常規(guī)藥敏試驗和報告規(guī)定選
擇抗生素。1 7種抗生素藥敏紙片購自杭州天和微生物試劑有限公司。
1.1.4細菌生化鑒定管
腸桿菌科細菌生化編碼微量鑒定管（11×20支/盒）購自杭州天和微生物試
劑有限公司。
1.2 方法
1.2.1選擇試驗豬場
選取新舊兩個有代表性的規(guī)模化養(yǎng)豬場，舊場建于1997年5月，由于建場歷史較久，曾經(jīng)出現(xiàn)過較大的疫情，目前場內(nèi)正在遭受斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征的影響，因此很經(jīng)常進行預防性用藥。對仔豬拉稀的治療原來有使用過氯霉素，現(xiàn)在主要以慶大霉素、恩諾沙星等藥為主，同時四環(huán)素類抗生素、磺胺類抗生素、阿莫西林、先鋒Ⅳ等藥現(xiàn)在經(jīng)常用于飼料添加。新場建于2003年年底，由于豬場建筑設計比較合理，飼養(yǎng)管理水平較高，豬場到目前為止未有大的疫情出現(xiàn)，預防性用藥很少，對仔豬拉稀的治療主要以恩諾沙星等藥為主。
1.2.2樣本采集
以滅菌棉簽采集仔豬新鮮拉稀糞便共36個樣本，將采集的標本置于滅菌的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)管中保存，其中新場17個樣本，舊場19個樣本。
1.2.3細菌的分離與純化
把營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)管中的糞便標本，用無菌接種棒挑取菌液接種于麥康凱瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)24小時，觀察菌落的生長情況。在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上形成粉紅色菌落后，挑取典型的單個菌落，接種于伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24小時，觀察形成紫黑色有或沒有金屬光澤的菌落；鏡檢為革蘭氏陰性、兩端鈍圓的小桿菌，單在或成對。
1.2.4細菌鑒定及保存
采用腸桿菌科細菌生化編碼微量鑒定管進行細菌的鑒定。將分離純化的可疑大腸桿菌菌株接種于系列細菌生化編碼微量鑒定管內(nèi)，37℃培養(yǎng)24小時后，對細菌生化反應結果進行判斷并編碼，按編碼值檢索腸桿菌科細菌生化編碼表即可獲得結果，對不確定菌株進一步補充生化反應予以判定。
經(jīng)生化反應鑒定為大腸桿菌者，在新鮮菌液中加入滅菌甘油制成10%（v/v）甘油菌，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/font>
1.2.5細菌藥敏試驗：
嚴格按照美國臨床實驗室標準委員會（National
Committee
for
Clinical
Laboratory
Standards， NCCLS）推薦的K-B法進行[4]。首先在營養(yǎng)瓊脂平板上挑取單個菌落接種于2ml普通肉湯管內(nèi)， 37℃培養(yǎng)16-18小時后，用MH肉湯調(diào)制菌懸液，使其達到0.5麥氏比濁管濁度。用滅菌棉拭子醮取調(diào)制好的菌懸液，均勻涂抹在MH瓊脂平板上，涂好后放置3-5分鐘，待培養(yǎng)基表面水分吸干后，即用無菌眼科鑷將藥敏紙片貼于平板上，各紙片中心相距＞24mm，紙片距平板內(nèi)緣＞15mm。37℃培養(yǎng)16-18小時后觀察結果。
1.2.6細菌藥敏試驗結果判定標準
參照NCCLS（1999）公布的標準以敏感（S）、中介（I）、耐藥（R）3種形式對抑菌圈大小作出解釋，判定標準如表1所示。
2 結果與分析
2.1 不同豬場大腸桿菌耐藥情況及比較
新舊兩豬場分離的大腸桿菌對抗生素的耐藥情況分別如表2和表3所示。本次試驗結果表明，在各類抗菌藥中，從兩個豬場分離到的大腸桿菌對四環(huán)素、復方新諾明等常用抗生素的耐藥率較高，對已經(jīng)不再使用的氯霉素也仍然有高的耐藥率，對氨基糖苷類的慶大霉素耐藥率較高，而同類的鏈霉素和丁胺卡那則較敏感。值得引起注意的是氟喹諾酮類抗生素在本次試驗中表現(xiàn)出比較高的耐藥率，而細菌對臨床少用的抗生素如多粘菌素、氨曲南、頭孢哌酮等藥物的敏感性較高。
對兩個場大腸桿菌的耐藥譜進行比較，結果如圖1所示。雖然兩個場建場時間不同，藥物使用習慣和使用頻率存在較大差異，但兩場的細菌耐藥譜卻比較一致，許多情況下僅為耐藥程度的差別?？傮w來說，舊場分離的細菌對各種抗生素表現(xiàn)出較高的耐藥率，一些在新場非常敏感的抗生素，在舊場已經(jīng)表現(xiàn)出一定程度的耐藥。比較其他學者的研究成果[5-6]發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌在不同的環(huán)境下對氨芐青霉素、阿莫西林、氯霉素、復方新諾明和四環(huán)素類藥物都比較容易產(chǎn)生較高水平的耐藥，而且這種耐藥性一般來說比較持久。
2.2 不同豬場大腸桿菌多重耐藥情況及比較
考察兩個豬場大腸桿菌多重耐藥情況，結果如圖2所示?？傮w而言，兩個場的細菌多重耐藥情況比較接近，新場分離細菌6重耐藥以下的細菌數(shù)明顯多于舊場，提示藥物使用頻率和程度對細菌多重耐藥的形成有直接的影響。從圖中可以了解到目前養(yǎng)殖場分離的大腸桿菌普遍存在對抗生素的多重耐藥現(xiàn)象，本試驗中許多細菌表現(xiàn)出對四環(huán)素、復方新諾明、氯霉素、氨芐青霉素、阿莫西林以及阿莫西林/棒酸合劑的共同耐藥，因此0-4重耐藥菌所占比例很小，6重耐藥細菌最多。同時一些細菌又發(fā)展出對氨基糖苷類或氟喹諾酮類藥物的耐藥性，所以6-10重耐藥細菌成為分離細菌的主體。本試驗中的10-11重耐藥菌，就是對臨床常用抗生素都耐藥的細菌，這部分細菌所占比例也不少，應該引起我們的高度重視。
Table 1
E.coli antibiotic resistance standard of K-B method 藥物名稱
| 含藥量
（μg/片）
| 抑 菌 圈 直 徑（mm）
| R
| I
| S
| 氨芐青霉素
| 10
| ≤13
| 14-16
| ≥17
| 阿莫西林
| 10
| ≤14
| 15-17
| ≥18
| 阿莫西林+棒酸
| 20+10
| ≤13
| 14-17
| ≥18
| 氨曲南
| 30
| ≤15
| 16-21
| ≥22
| 亞氨培南
| 10
| ≤13
| 14-15
| ≥16
| 頭孢哌酮
| 75
| ≤15
| 16-20
| ≥21
| 頭孢唑啉
| 30
| ≤14
| 15-17
| ≥18
| 丁胺卡那
| 30
| ≤14
| 15-16
| ≥17
| 慶大霉素
| 10
| ≤12
| 13-14
| ≥15
| 鏈霉素
| 10
| ≤11
| 12-14
| ≥15
| 氯霉素
| 30
| ≤12
| 13-17
| ≥18
| 四環(huán)素
| 30
| ≤14
| 15-18
| ≥19
| 新諾明+TMP
| 23.75+1.25
| ≤10
| 11-15
| ≥16
| 多粘菌素
| 300u
| ≤8
| 9-12
| ≥13
| 環(huán)丙沙星
| 5
| ≤15
| 16-20
| ≥21
| 諾氟沙星
| 10
| ≤12
| 13-16
| ≥17
| 氧氟沙星
| 5
| ≤12
| 13-15
| ≥16
|
注：本表整理自美國NCCLS藥敏紙片擴散法法規(guī)及操作規(guī)程
Table 2
E.coli antibiotic resistance model of old pig farm 藥敏紙片
細菌總數(shù)
| R
| I
| S
|
| 細菌數(shù)
| %
| 細菌數(shù)
| %
| 細菌數(shù)
| %
| 氨芐青霉素
阿莫西林
| 75
| 69
92.0
| 4
5.3
| | 75
| | | | 阿莫西林/棒酸
60
| | | | 氨曲南
75
| 0
0
| | | 亞氨培南
64
| | | | 頭孢哌酮
75
| | | | 頭孢唑啉
75
| | | | 丁胺卡那
75
| | | | 慶大霉素
56
| | | | 鏈霉素
56
| | | | 氯霉素
75
| | | 四環(huán)素
75
| | 0
0
| | 新諾明+TMP
75
| | | | 多粘菌素
56
| | | | 環(huán)丙沙星
75
| | | | 諾氟沙星
69
| | | | 氧氟沙星
75
| | | | | | | | | | | |
Table 3
E.coli antibiotic resistance model of new pig farm 藥敏紙片
細菌總數(shù)
| R
| I
| S
|
| 細菌數(shù)
| %
| 細菌數(shù)
| %
| 細菌數(shù)
| %
| 氨芐青霉素
阿莫西林
| 67
| 61
91.0
| 1
1.5
| 5
7.5
| 67
| 61
91.0
| 2
3.0
| 4
6.0
| 阿莫西林/棒酸
54
| 49
90.7
| 3
5.6
| 2
3.7
| 氨曲南
67
| 0
0
| 2
3.0
| 65
97.0
| 亞氨培南
64
| 0
0
| 3
4.7
| 61
95.3
| 頭孢哌酮
67
| 0
0
| 2
3.0
| 65
97.0
| 頭孢唑啉
67
| 0
0
| 13
19.4
| 54
80.6
| 丁胺卡那
67
| 7
10.5
| 0
0
| 60
89.5
| 慶大霉素
64
| 21
32.8
| 6
9.4
| 37
57.8
| 鏈霉素
54
| 3
5.6
56
83.5
| 0
0
| 51
94.4
| 氯霉素
67
| 3
4.5
| 8
12.0
| 四環(huán)素
67
| 65
97.0
| 0
0
| 2
3.0
| 新諾明+TMP
67
| 59
88.1
| 0
0
| 8
11.9
| 多粘菌素
67
| 0
0
| 0
0
| 67
100
| 環(huán)丙沙星
67
| 23
34.3
| 2
3.0
| 42
62.7
| 諾氟沙星
69
| 20
33.3
| 0
0
| 40
66.7
| 氧氟沙星
67
| 24
35.8
| 1
1.5
| 42
62.7
| | | | | | | | |
3討論
3.1藥物使用頻率與耐藥率的關系
四環(huán)素類抗生素和氯霉素類抗生素在新場使用較少，但試驗結果卻表明細菌對這兩種抗生素有較高的耐藥率，這可能與引進種豬體內(nèi)攜帶的耐藥菌群有關，據(jù)了解，新場的原種場建場時間為1998年。這同時提示我們，對這兩種抗生素已經(jīng)形成耐藥的細菌，即使停藥較長時間也不容易恢復到敏感狀態(tài)。
3.2抗生素的交叉耐藥性
調(diào)查發(fā)現(xiàn)，耐藥菌株表現(xiàn)出了對同類抗生素的交叉耐藥性，這在氟喹諾酮類和氨基糖苷類抗生素表現(xiàn)得特別明顯，環(huán)丙沙星、諾氟沙星、氧氟沙星都是氟喹諾酮類抗生素，近年來其耐藥率有不斷積累的趨勢。本次試驗表明臨床分離的大腸桿菌已經(jīng)有相當程度的耐藥率。有文獻報道氧氟沙星在該類抗生素中較少誘導出耐藥菌[7]，本次試驗可能是由于交叉耐藥現(xiàn)象的存在，結果顯示臨床分離細菌對氧氟沙星的耐藥率也比較高。因此，獸醫(yī)臨床用藥應根據(jù)藥敏試驗結果，有針對性地使用，同時要首先選用不容易誘導細菌產(chǎn)生耐藥性的藥物，而且必須經(jīng)常更換抗生素種類，以免產(chǎn)生新的耐藥菌株。
目前，獸醫(yī)臨床上抗生素的廣泛、長期使用導致許多菌種的耐藥性增強，這不僅給控制和治療疾病帶來困難，而且加劇了抗生素在畜禽體內(nèi)的殘留，嚴重危害動物食品安全[8]。面對世界上對抗生素在食品動物上使用的限制日益嚴格的趨勢，加強開發(fā)抗生素替代產(chǎn)品成為必然，其中中草藥以其低毒性、低殘留、不容易誘導細菌耐藥性等特點，成為許多研究的熱點，今后仍然有必要加強這方面的研究[9]。同時，面對日益嚴重的耐藥性問題，獸醫(yī)臨床有必要定期對豬場的常見病原菌進行藥物敏感性試驗，而且要加強耐藥性的流行病學研究，對目前在飼料中廣泛添加阿莫西林、磺胺類、四環(huán)素類藥物的有效性有必要進行合理的評價。
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[9]黃一帆. 淺談21世紀中獸醫(yī)學的發(fā)展[J]. 福建畜牧獸醫(yī). 2000，（1）：15-16
基金項目：福建省自然科學基金資助項目（ ）
作者簡介：俞道進（1974—），男，講師，博士. 研究方向：獸醫(yī)藥理與毒理 | 
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發(fā)表于 2008-5-26 11:28:12
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