檢測口蹄疫病毒抗原的方法

曹志誠

檢測口蹄疫病毒抗原的方法

（一）口蹄疫反向被動紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)（反向被動血凝）

紅細(xì)胞膜具有吸附抗原或抗體的特性，將提純的口蹄疫抗體（IgG）在pH4.0醋酸緩沖液中致敏綿羊紅細(xì)胞，當(dāng)這種被致敏的紅細(xì)胞（即紅細(xì)胞表面均帶有口蹄疫抗體），遇到相應(yīng)的口蹄疫病毒抗原時(shí)，便產(chǎn)生抗原抗體的特異性反應(yīng)，從而使紅細(xì)胞發(fā)生肉眼可見的凝集現(xiàn)象。該法快速、簡便、準(zhǔn)確、可同步鑒定出口蹄疫毒型和鑒別口蹄疫、豬水泡病病原。
    1．試驗(yàn)材料
V型96孔130o血凝滴定板、玻璃吸管（1毫升、5毫升規(guī)格）、玻璃中試管（內(nèi)徑15毫米，長度100毫米）、試管架、微量振蕩器、微量移液器、塑料咀、玻璃板（與血凝板大小一致）、口蹄疫O、A、C、Asia-I 型、SVD（豬水泡病）反向被動血凝診斷試劑及其配套用的口蹄疫各型、豬水泡病陽性抗原、陰性抗原、稀釋液、待檢抗原。
２．試驗(yàn)方法
?。ǎ保┫♂尨龣z抗原  取中試管8支，橫列于試管架上，每管各加入稀釋液1 毫升，取待檢抗原1毫升加入第1管混勻后從中取出1毫升加入第2管，混勻后取1毫升加入第3管……直至第8管，此時(shí)待檢抗原的稀釋度依次為1：6、1：12、1：24、1：48、1：96、1：192、1：384、1：768。
?。ǎ玻┫♂岅幮钥乖?/strong>取中試管1支用記號筆標(biāo)明“陰抗”字樣，加入稀釋液390微升，加入陰性抗原10微升，充分混勻，此時(shí)陰性抗原的稀釋度為1：40。
?。ǎ常┫♂岅栃钥乖?/strong>  取中試管20支，橫列于管架標(biāo)明“陽抗”字樣，每排4支，（O型4支、A型4支、C型4支、Asia-1型4支、SVD4支）。每種陽抗第1管，加稀釋液4.7毫升，第2~4管各加稀釋液0.5毫升。取O型陽性抗原0.1毫升(100微升)加入第1排的第1管中混勻后取出0.5毫升，加入第1排的第2管并充分混勻，取出0.5毫升加入第1排的第3管混勻后取出0.5毫升加入第1排的第4管并混勻。
    其他陽性抗原均按上法稀釋，注意每稀釋一種陽抗必須更換1支吸管，切勿混雜以免影響反應(yīng)的特異性。經(jīng)過上述稀釋，各陽性抗原的稀釋度依次為1：48、1：96、1：192和1：384。用于陽抗對照孔的只加第4管（1：384）的陽抗。
?。ǎ矗┑渭哟龣z抗原和對照抗原　取第8管稀釋的待檢抗原（1：768）加入血凝滴定板上的1~5排的第8孔，每孔50微升，取第7管待檢抗原（1：384）加入1~5排的第7孔，取第6管待檢抗原（1：192）加入1~5排的第6孔……直至第1孔，每孔均為50微升。1~5排的第10孔加入1：40的陰性抗原，每孔50微升。1-5排的第11孔依次加入O、A、C、 Asia-1型和SVD1：384稀釋度的陽性抗原，每孔50微升（即第1排的第11孔加O型抗原；第2排的11孔加A型抗原；第3排的11孔加C型抗原；第4排的11孔加Asia –1型抗原；第5排的11孔加SVD抗原）。1-5排的第12孔各加稀釋液50微升作為稀釋 液對照。
　（５）滴加反向被動血凝診斷液  血凝板上的第1排1~8孔和10~12孔加O型診斷液，每孔25微升。第2排1~8孔和10~12孔加入A型診斷液，每孔25微升。第3排1~8孔和10~12孔加入C型診斷液，每孔25微升。第4排1~8孔和10~12孔加入Asia-1型診斷液，每孔25微升。第5排1~8孔和10~12孔加入SVD診斷液，每孔25微升。
　（６）振蕩血凝板　加畢診斷液后，立即將血凝板置于微量振蕩器上，中速振蕩30秒，取下血凝板放在白紙上觀察各孔的紅細(xì)胞是否均勻懸浮，孔底應(yīng)無紅細(xì)胞沉淀，若全部或部分孔底尚有紅細(xì)胞沉積，應(yīng)繼續(xù)在振蕩器上振蕩，直至充分混勻?yàn)橹埂?/font>
?。ǎ罚┦覝叵蚂o置  將混勻的血凝板，蓋上玻璃板后靜置2小時(shí)，判定檢測結(jié)果，若對照孔紅細(xì)胞沉降不清晰或因故來不及判定，也可靜置第2天判定。
３． 判定標(biāo)準(zhǔn)
先觀察血凝板上1~5排的10~12孔，每排的第10孔為陰性抗原對照孔，應(yīng)無凝集現(xiàn)象，紅細(xì)胞應(yīng)全部沉入孔底，形成邊緣整齊的小圓點(diǎn)；每排的11孔為陽性抗原對照孔，應(yīng)出現(xiàn)“++” ~“#”的凝集現(xiàn)象（即有50~100%紅細(xì)胞發(fā)生凝集，紅細(xì)胞懸于孔中，不沉入孔底），證明所加的反向診斷液效價(jià)不低于1：384，用于檢測抗原合格；每排的第12孔為稀釋液對照孔，也應(yīng)無凝集現(xiàn)象，紅細(xì)胞應(yīng)全部沉入孔底，形成小圓點(diǎn)。
在上述對照孔判定合格的前提下，仔細(xì)觀察血凝板上的1~5排的1~8孔，某排1~8孔或1~6孔均有“++” ~“#”凝集現(xiàn)象，而其余4排僅在1~2孔出現(xiàn)“+” ~ “++”的凝集，即可判定該份待檢抗原為陽性。其型別與所加的反向診斷液的型別相同。比如第1排1~8孔出現(xiàn)“++”以上的紅細(xì)胞凝集，第2~5排無此現(xiàn)象，便可判定該待檢抗原為O型口蹄疫。
以出現(xiàn)“++”以上凝集的待檢抗原最大稀釋度為其抗原滴度。例如第1排的1~4孔出現(xiàn)“#”凝集，第5孔出現(xiàn)“+++”凝集第6孔出現(xiàn)“++”凝集，第7孔出現(xiàn)“+”凝集，第8孔無凝集現(xiàn)象，即判定該待檢抗原為O型，滴度為1：192（以第6孔出現(xiàn)“++”凝集為滴度的終點(diǎn)）。
４．注意事項(xiàng)
　（１）勿用90o和110 o血凝板，防止誤判。

（２）陰性抗原、陽性抗原和稀釋液3孔對照全部或部分出現(xiàn)不合格時(shí)，檢測結(jié)果不能判定，應(yīng)更換試劑重新檢測，以免錯判。
?。?/font>３）嚴(yán)重腐敗變質(zhì)的病料不宜檢測，以防非特異反應(yīng)。
?。ǎ矗┎×咸?，無法檢測時(shí)，可制成1：10或1：20懸液，先接種3~5日齡小白鼠，連傳3代后，用鼠組織制成待檢抗原，再進(jìn)行檢測。
?。ǎ担z測過程中，有時(shí)出現(xiàn)前帶現(xiàn)象，即第1孔或第2孔的紅細(xì)胞沉淀形成小園點(diǎn)，第3孔以后又出現(xiàn)“++”以上的凝集，這是因?yàn)榭乖贵w比例失調(diào)所致，不影響結(jié)果判定。
    反向被動紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)的診斷液及其配套試劑由中國農(nóng)科院蘭州獸醫(yī)研究所供應(yīng)。
（二）口蹄疫微量補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)
    補(bǔ)體的作用是無特異性的，它能與任何一組抗原抗體復(fù)合物結(jié)合并不再游離。但不能單獨(dú)與抗原或抗體結(jié)合。當(dāng)抗原與其相應(yīng)的抗體結(jié)合成復(fù)合物之后，可與補(bǔ)體結(jié)合，但這種反應(yīng)不能用肉眼觀察。如果抗原是紅細(xì)胞與其相應(yīng)抗體（溶血素）形成復(fù)合物后，當(dāng)有補(bǔ)體存在時(shí)，紅細(xì)胞就發(fā)生溶血；如補(bǔ)體已被其他抗原抗體復(fù)合物結(jié)合，則不溶血。這種現(xiàn)象用肉眼是可以觀察到的。因此利用溶血反應(yīng)作為指示劑，以檢驗(yàn)補(bǔ)體是否已被前一種抗原抗體系統(tǒng)所結(jié)合，這種試驗(yàn)叫做補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)。前者稱為溶菌系統(tǒng)或試驗(yàn)系統(tǒng)，后者稱為溶血系統(tǒng)。如果溶菌系統(tǒng)的抗原抗體是相應(yīng)的，則補(bǔ)體被結(jié)合，加入溶血系統(tǒng)后不發(fā)生溶血。反之，二者不對應(yīng)，則補(bǔ)體游離，加入溶血系統(tǒng)后發(fā)生溶血。所以在補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)中，溶血判為陰性；不溶血則判為陽性。
操作步驟如下：
１．測定溶血素效價(jià)
    （1）取試管10支列于管架上，1~10管內(nèi)各加生理鹽水0.5毫升
    （2）取溶血素0.2毫升加生理鹽水9.8毫升=1:100 的溶血素。
    （3）取1：100的溶血素1毫升加生理鹽水4毫升=1：500溶血素。
    （4）取1：500的溶血素0.5毫升 加入第1管混勻并取出0.5毫升加入第2管混勻，并取出0.5毫升加入第3管……以此類推，直至第8管。并取出0.5毫升棄去，1~8管的溶血素稀釋度依次為1：1 000~1：8 000，第9、10管為對照管。
    （5）將補(bǔ)體（豚鼠血清）用生理鹽水稀釋成1：10，1~9管各加0.5毫升，第10管不加補(bǔ)體而加1：500的溶血素0.5毫升。
    （6）將洗凈的紅細(xì)胞沉淀用生理鹽水配成2%濃度，1~10管各加0.5毫升。
    （7）每管充分混勻置37℃水浴中作用20分鐘后判定效價(jià)。
（8）以出現(xiàn)完全溶血的溶血素最大稀釋度為其效價(jià)。

溶血素效價(jià)滴定表（劑量毫升）

試管號             1    2 3   4   5    6   7   8    9 10

生理鹽水          0.5  0.5  0.5  0.5  0.5  0.5  0.5 0.5 0.5  0.5 1：500溶血素     0.5

補(bǔ)體（1：10）     0.5  0.5  0.5  0.5  0.5  0.5  0.5  0.5  0.5  0.5(1:500溶血素)

紅細(xì)胞（2%）      0.5  0.5  0.5  0.5  0.5  0.5  0.5  0.5  0.5  0.5

37℃20分鐘 判定效價(jià) —   —   —   —   +   ++   +++   ＃   ＃   ＃

按此表滴度結(jié)果，該溶血素效價(jià)＝1：4 000，工作濃度為效價(jià)的4倍即1：1 000。
1． 測定補(bǔ)體效價(jià)
溶血素效價(jià)被測出后，即可滴定補(bǔ)體效價(jià)。新鮮補(bǔ)體或凍干補(bǔ)體被稀釋后，容易失效，宜用10% NaCl保存，即補(bǔ)體1份十10%Nacl 1份，混合后置4℃或-20℃貯存有效期2~3個月。
取保存補(bǔ)體2毫升加生理鹽水8毫升=1：10的補(bǔ)體。
按下表程序及劑量進(jìn)行滴定。

補(bǔ)體效價(jià)滴定表    （劑量:毫升）

試管號              1      2       3       4    5      6      7       8

生理鹽水          0.05    0.1     0.15    0.2    0.25    0.3   0.35   0.4

補(bǔ)體（1：10）     0.45    0.4     0.35    0.3    0.25    0.2   0.15   0.1

溶血素（工        0.5     0.5     0.5     0.5    0.5     0.5   0.5    0.5 作濃度）

紅細(xì)胞（2%）     0.5     0.5     0.5     0.5    0.5      0.5   0.5    0.5

37℃30分鐘 判 定 —      —     —       +      ++      +++    ＃     ＃

以出現(xiàn)完全溶血的補(bǔ)體最大稀釋度為其效價(jià)。

按此表測出的該補(bǔ)體效價(jià)為0.35，工作濃度為0.45。
以上A和B兩步驟稱為預(yù)備試驗(yàn)，溶血素一般半年滴定一次。而補(bǔ)體則必須在每次試驗(yàn)前滴定，如果補(bǔ)體效價(jià)不準(zhǔn)確，將會影響試驗(yàn)的結(jié)果。
    3．將標(biāo)準(zhǔn)血清（已知陽性血清）用生理鹽水稀釋成1：4（陰性血清1毫升加生理鹽水3毫升）。標(biāo)準(zhǔn)血清的補(bǔ)反效價(jià)必須達(dá)到1：80以上）。
    4．在96孔或24孔U型微量滴定板上，1~5排的1~7孔，各滴2滴（約50微升）生理鹽水，半小時(shí)后棄去，以防板孔對反應(yīng)成分的非特異吸附。
① 將待檢抗原稀釋成1：3、1：6、1：12和1：24，分別滴入1~5排的1~4孔，每孔1滴（約25微升）。
② 第1-5排的第5孔滴入陰性抗原各1滴；1~5排的第6孔依次分別滴入O、A、C、Asia-I 型和SVD陽性抗原1滴，1~5排的第7孔各滴入鹽水1滴,作為陰性、陽性和鹽水對照。
③ 1~5排的1~4孔依次分別加入O、A、C、Asia-I 型和SVD標(biāo)準(zhǔn)清1滴（25微升）。
④ 1~5排的1~7孔各加補(bǔ)體工作濃度2滴（50微升）。
⑤ 微量振蕩器上振蕩1分鐘，37℃溫箱保溫40分鐘。
⑥ 每孔各加溶血素工作濃度1滴。
⑦ 每孔各加2%紅細(xì)胞1滴。
⑧ 振蕩器上振蕩一分鐘，37℃溫箱30分鐘后判定結(jié)果。
5．判定標(biāo)準(zhǔn)：先檢查對照孔，第5和第7孔應(yīng)完全溶血為合格；第1~5排的第1~4孔中任一孔呈現(xiàn)不溶血則判該份待檢抗原為陽性，其型別與所加標(biāo)準(zhǔn)血清的型別相同。
該法操作較繁瑣，敏感性低，但特異強(qiáng)。
（三）口蹄疫酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）
八十年代以來，國外常采用ELISA鑒定口蹄疫和豬水泡病病毒。國內(nèi)也有人試用該法對FMDV 和SDV進(jìn)行檢測，由于IgG的純度不高，經(jīng)常出現(xiàn)非特異性反應(yīng)。影響檢測的準(zhǔn)確性，使推廣應(yīng)用受到限制。
ELISA技術(shù)雖然多種多樣，但一般以雙抗體夾心法居多。用最適濃度抗口蹄疫血清的IgG包被酶標(biāo)板孔4℃過夜，經(jīng)洗滌后加入待檢抗原37℃保溫1小時(shí)，洗滌后再加辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗豚鼠血清的IgG 37℃保溫1小時(shí)，洗滌后加底物溶液（鄰苯二胺和H2O2），30分鐘后用2M H2SO4中止反應(yīng)，751型分光光度計(jì)492nm測定光密值或在酶標(biāo)檢測儀上直接測定。陽性O(shè)D值為0.7~0.9；陰性O(shè)D值為0.1~0.3。
（四）免疫熒光直接檢檢測口蹄疫帶毒肉品的操作方法
    1．試驗(yàn)材料
   （1）熒光顯微鏡及自動照相裝置       1臺
   （2）冰凍組織切片機(jī)                 1臺
   （3）電熱恒溫箱            
       1臺
   （4）玻璃染色缸                     2具
   （5）玻璃片                         5盒
   （6）組織切片盒                     2個

（7）抗體（O型、A型、Asia-I型、SVD等4種）

（8）0.01MpH7.2~7.4的PBS
   （9） 丙酮
   （10） 伊文斯蘭（萬分之二濃度）
    2．操作方法
    （1）剝離淋巴結(jié)周圍的脂肪及被膜，將淋巴結(jié)剪成長1.5~2cm ,寬0.8~1cm 厚 0.3~0.5cm的組織塊。

（2）在冷凍組織切片機(jī)上，低溫切成5~6微米的薄片，每份淋巴結(jié)切片8張，迅速粘貼在潔凈的載玻片上，并用記號筆編號。

（3）
冷丙酮固定（室溫下20分鐘或在4℃下30分鐘）。
    （4）0.01MpH7.2~7.4 PBS漂洗3次，每次1分鐘，用濾紙吸去樣品周圍水份，切勿碰損樣品，再用吹風(fēng)機(jī)吹干樣品。
    （5）滴加熒光抗體工作液，以復(fù)蓋樣品為度，置溫盒37℃溫箱保溫30分鐘。
    （6）PBS洗3次，濾紙吸水并吹干。
    （7）熒光顯微鏡下觀察。


3．判定標(biāo)準(zhǔn)

（1） 先判定已知陰性淋巴結(jié)切片染色結(jié)果，僅見組織細(xì)胞的輪廓，應(yīng)無翠綠色光點(diǎn)出現(xiàn)，或見少數(shù)（視野內(nèi)少于5個）橙黃色小點(diǎn)，視為合格。
    （2）細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)成堆的有時(shí)呈放射狀翠綠色亮點(diǎn)，判為“#”；胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)5個以上翠綠色熒光點(diǎn)為“+++”胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)2~3個綠色熒光點(diǎn)為“++”；視野中僅見1~2個綠色熒光點(diǎn)為“+”，未見任何熒光點(diǎn)則為“—”。
    （3）出現(xiàn)“++”以上（含“++”）的熒光判為陽性，“+”判為可疑，“—”為陰性。
     4． 注意事項(xiàng)

（1）根據(jù)本地及鄰近地區(qū)的疫情，認(rèn)為有必要時(shí)，每份樣品應(yīng)切片8張，每種熒光抗體染色2張切片進(jìn)行觀察。無必要時(shí)，每份樣品只切2張，用O型熒光抗體染色亦可。
    （2）每次檢測應(yīng)選1~2份陰性淋巴結(jié)在相同條件下切片染色和觀察，以作陰性對照。
    （3）每次均應(yīng)照相保存，以備查考。
    （4）為慎重判定起見，檢出的陽性樣品應(yīng)凍結(jié)保存，并應(yīng)接種3~5日小白鼠盲傳2~3代，每代72小時(shí)撲殺，注意觀察癥狀，最后反向間接血凝診斷液復(fù)檢判定。
    （5）采集的淋巴結(jié)應(yīng)新鮮（凍肉內(nèi)的淋巴結(jié)亦可），避免反復(fù)凍融，盡量保持樣品細(xì)胞的完整性。腐敗變質(zhì)的淋巴結(jié)不宜檢測。
（6）熒光染色前，可用萬分之二的伊文斯蘭染液，浸染1分鐘，立即以PBS洗3次，可降低樣品自發(fā)熒光的強(qiáng)度。

紀(jì)明科

化驗(yàn)室應(yīng)用比較好，好多豬場用不到呀！