飼料中粗蛋白測定方法

泡泡 · 發(fā)表于 2008-9-26 09:39:23

1、凱氏定氮法的原理
1.1 消化：樣品與硫酸一同加熱消化，硫酸使有機物脫水，破壞有機物，有機物中的碳和氫氧化為二氧化碳和水逸出，而蛋白質(zhì)分解成氨，則與硫酸結合成硫酸銨留在酸性溶液中。其反應式如下：
H2SO4→SO2+H2O+﹝O﹞
2CH3.CH.NH2.COOH+2﹝O﹞→2CH3.CHOH-NH2+2CO2
2CH3.CHOH.NH2+10﹝O﹞→4CO2+2NH3+4H2O
2NH3+H2SO4→(NH4)2SO4
在消化過程中添加硫酸鉀可以提高溫度加快有機物分解，它與硫酸反應生成硫酸鉀，可提高反應溫度，一般純硫酸反應生成硫酸氫鉀，可提高反應溫度，一般純硫酸加熱沸點330℃，而添加硫酸鉀后，溫度可達400℃，加速了整過反應的過程。此外，也可以加入硫酸鈉、氯化鉀等鹽類來提高沸點。其理由隨著消化過程硫酸的不斷的分解，水分的逸出而是硫酸鉀濃度增大，沸點增加。加速了有機物的分解。其反應式如下：
K2SO4+H2SO4=2KHSO4
2KHSO4=K2SO4+H2O+SO3
但硫酸鉀加入量不能太大，否則溫度過高，生成硫酸銨也會分解，放出氨而造成損失。
（NH4）2SO4→NH3↑+NH4HSO4
2 NH4HSO4→2 NH3↑+2 SO4↑+2H2O
為了加速反應過程，還加入硫酸銅，氨化汞或硒粉作為催化劑以及加入少量過氧化氫，次氯酸鉀作為氧化劑，但為了防止污染通常使用硫酸銅，其反應式如下：
2GuSO4→Gu2SO4+ SO2↑+O2↑
5O2+2GuSO4→GuSO4+ SO2↑+6O2↑
GuSO4+H2SO4→2GuSO4+ SO2↑+H2O
所以有機物全部消化后，出現(xiàn)硫酸銅的藍綠色，它具體由催化功能，還可以作為堿性反應指示劑。
1.2
蒸餾：樣液中的硫酸銨在堿性條件下釋放出氨，在這一操作中，一是加入氫氧化鈉溶液要過量；二是防止樣液中氨氣逸出，其反應如下：
2（NH4）2SO4+2NaOH→NH3↑+Na2SO4+H2O
1.3
吸收與滴定：蒸餾過程中放出的氨可用一定量的標準硫酸或鹽酸溶液進行吸收。然后再用標準氫氧化鈉溶液反滴定過剩的硫酸或鹽酸溶液，從而計算出總氨量。半微量或微量蒸餾定氮通常用硼酸溶液吸收后，再用標準鹽酸溶液之間滴定，硼酸呈微弱的酸性，用酸滴定不影響指示劑變色反應，它有吸收氨的作用，其反應如下：
2NH3+4H3BO3→（NH4）2B4O7+5 H2O
（NH4）2B4O7+2HCI+5 H2O→2NH4CL+4H3BO3
1.4 混合指示劑：標準鹽酸溶液滴定吸收液中的氨的PH值突躍范圍為6.3-4.3。采用甲基紅-溴甲酚綠混合指示劑，終點顏色由綠色變?yōu)榛壹t色。

	PH＜5.1	PH=5.1	PH＞5.1
溴甲酚綠	黃色	綠色	藍色
甲基紅	紅色	橙色	黃色
甲基紅+溴甲酚綠	酒紅色	灰色	藍綠色

2、定氮儀
2.1 對半微量定氮儀的要求：必須是水蒸氣蒸餾，蒸餾速度為10-20分鐘內(nèi)蒸出液量達70-100毫升，氨的回收率在97%以上，一起加堿空蒸時，蒸出液空白要低。
2.2 操作定氮儀注意事項：
2.2.1本儀器必須在無氮及氨化物污染的專用實驗室內(nèi)工作。
2.2.2所有的蒸餾水均為無氨水。
2.2.3蒸餾試樣前必須清洗儀器，并對儀器進行檢漏。
2.2.4新的蒸餾裝置或久不使用的裝置，冷凝管不要通冷凝水，先通水蒸氣洗凈。
2.2.5在分析試樣前，蒸餾50毫升水溶液檢查空白，空白低時才能進行試樣分析。
3、飼料粗蛋白測定方法操作注意點
3.1試樣消煮，加催化劑［GuSO4.5 H2O:Na2SO4(無水)=1:15(質(zhì)量比)］3.2克、加濃硫酸13毫升。
3.2 消化時間視不同樣品含脂肪、蛋白質(zhì)而定，一般樣液呈現(xiàn)藍綠色后消化30分鐘就可以（高蛋白及有爭議的樣品應按國標消化至樣液出現(xiàn)藍綠色后消化2小時。
3.3 無損失的將消化液由凱氏燒瓶轉(zhuǎn)入100ml容量瓶中，并用蒸餾水洗凱氏燒瓶2-3次，洗液一并倒入容量瓶中。
3.4 配置的20g/l硼酸液不能被酸污染，三角燒瓶應洗凈，一旦顯色不對，洗凈后重新吸取硼酸液和指示劑。
3.5 加蒸餾水空蒸，一要對定氮儀檢漏；二要檢蒸餾液的ＰＨ值不能太高，最好控制在ＰＨ值６－７之間。
3.6 要先塞好入口玻璃塞，再加堿液，小心提起玻塞使之流入反應室，將玻璃塞塞好，且在入口出加水封好。防止氨損失和漏氣。同時要嚴防反應室里分解試樣和堿液倒吸出來。反應室內(nèi)液量不能太多。
3.7 控制好水蒸氣發(fā)生器溫度，不能過高（測定結果偏高）；不能過低（測定結果偏低）?？捎靡慌_調(diào)壓器與電爐串聯(lián)，以硫酸銨校正值確定電壓大小。
3.8 應隨時用分析純硫酸銨代替試樣來校正加堿，蒸餾和滴定各步驟地操作。
3.9 蒸餾完畢，拔入口處玻璃塞動作要輕柔。防止反應室內(nèi)堿液倒噴入冷凝管內(nèi)，避免給下一個試樣分析帶來較大的誤差。
3.10 滴定操作禁止放長線滴定。
3.11 每換一批藥品試劑、標液要用蔗糖（分析純）代替試樣進行空白測定。
3.12 消化溫度應控制在400℃至420℃內(nèi)。消化器控溫器應良好，電阻絲應使用專用配套電阻絲，拉伸應均勻，使爐內(nèi)溫度均勻，沒有房消化管的孔上用瓷坩堝蓋蓋上。
CP(%)＝(V2-V1)×C×0.014×6.25×100 /W×V1／V
式中：V2—滴定試樣時所需酸標準溶液體積，ml；
V1—滴定空白時所需酸標準溶液體積，ml；
C—鹽酸標準溶液的物質(zhì)的量濃度，mol/L；
W—試樣重量g；
V—試樣分解液總體積，ml；
V1—試樣分解液蒸餾用體積，ml；
0.014—氨的摩爾質(zhì)量g/m mol；
6.25—氨換算成蛋白質(zhì)的平均系數(shù)。
在實際分析應用中通常V1=0.1 ml
V=100 ml如若C（HCL）=0.0493 mol/ ml
V1=5 ml
那么粗蛋白質(zhì)計算公式可簡化為：
CP(%)＝(V2-0.10)×0.0493×0.014×6.25×100 /W×5／100