副豬嗜血桿菌的分離鑒定

bluewing2003

副豬嗜血桿菌（HPS）引起豬的多發(fā)性漿膜炎與關節(jié)炎，以纖維素性多發(fā)性漿膜炎、關節(jié)炎和腦膜炎為特征,我國以血清4型和5型最為流行，其次為13型、14型和12型。下面就如何分離鑒定HPS做一個闡述。
一、病原菌的分離、鑒定
無菌操作從疑似病豬的鼻腔、肺臟、胸膜、胸腹腔積水、心包積液、心血、關節(jié)液和腦組織等病料中取樣，在無菌操作臺上，用接種環(huán)分別挑取上述可疑菌的單菌落，水平劃線于無NAD的綿羊鮮血平皿上，再挑取金黃色葡萄球菌垂直于水平線劃線，37℃培養(yǎng)24-48h，看是否有“衛(wèi)星生長現(xiàn)象”（即在葡萄球菌菌苔附近待測菌菌落生長較大，而遠側菌落生長較小甚至沒有菌落生長），同時觀察是否具有溶血現(xiàn)象。取具有“衛(wèi)星生長現(xiàn)象”且不溶血的單菌落純培養(yǎng)后接種于脲酶、氧化酶、接觸酶、硝酸鹽還原、吲哚、葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、核糖和麥芽糖等微型生化鑒定管，按廠家說明書的方法操作并觀察結果。
二、結果判定
副豬嗜血桿菌在綿羊鮮血瓊脂平板上與金黃色葡萄球菌交叉劃線，37℃培養(yǎng)24~48h后，呈現(xiàn)典型的“衛(wèi)星生長現(xiàn)象”，即越靠近葡萄球菌的周圍其生長越好，遠離葡萄球菌的地方不生長，并且在鮮血瓊脂平板上的副豬嗜血桿菌菌落周圍不出現(xiàn)溶血現(xiàn)象。將副豬嗜血桿菌接種于微量生化鑒定管，37℃培養(yǎng)48h后，結果為脲酶試驗陰性，氧化酶試驗陰性，接觸酶試驗陽性，硝酸鹽還原試驗陽性，吲哚試驗陰性并發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、核糖和麥芽糖等碳水化合物

生化鑒定項目	HS79(4型標準菌)	HS80(5型標準菌)
NAD-依賴性	+	+
溶血性	-	-
脲酶	-	-
硝酸鹽還原	+	+
吲哚	-	-
氧化酶	-	-
接觸酶	+	+
葡萄糖	+	+
麥芽糖	+	+
蔗糖	+	+
果糖	+	+
核糖	+	+
半乳糖	+	+

三、分子生物學檢測(PCR)將被檢菌株菌液10,000r/min離心5min，棄上清液，用無菌水懸浮，渦旋后，于沸水中水浴10min后，再放置-20℃凍結。凍融后10,000r/min離心5min，取上清液作模板?；驅⒎蛛x純化的菌株用接種環(huán)刮取2個菌落洗脫于含100µl無菌水的離心管中，再同上渦旋，水浴，凍融及離心作模板。
根據(jù)副豬嗜血桿菌16S rRNA（M75065）序列設計引物，由上海生工公司合成：
上游引物：5’-GGC TTC GTC ACC CTC TGT –3
下游引物：5’-GTG ATG AGG AAG GGT GGT GT –3
反應體系（50µl）：10倍緩沖液5µl，25mmol/L MgCl2 1.5µl，dNTPs 1.0µl，1.5umol/L上游引物1.5µl，1.5umol/L 下游引物1.5µl, ExTaqE 0.5µl，滅菌雙蒸水9µl，模板10µl。反應條件：94℃變性4min；94℃ 50s，59℃ 50s，72℃ 1min，72℃ 10min，PCR產(chǎn)物4℃保存。
四、結果判定根據(jù)副豬嗜血桿菌16S rRNA序列設計引物經(jīng)PCR擴增的產(chǎn)物為822 bp大小的片段。

潲水娃

好高深莫測，看不懂