在發(fā)酵的角度廓清“后抗生素時(shí)代”的含義

葉赫娜蘭.孤城

大家都說(shuō)“后抗生素時(shí)代”，除了歐盟禁抗帶來(lái)的畜牧行業(yè)的緊迫外，它的含義還有另一個(gè)。n

那就是，在以往（2005-2006以前），發(fā)酵處于抗生素時(shí)代?？股貢r(shí)代的含義，是指，以抗生素工藝代表最高發(fā)酵技術(shù)，引導(dǎo)行業(yè)。以抗生素工藝評(píng)價(jià)體系為整個(gè)發(fā)酵行業(yè)的指導(dǎo)。也即，抗生素發(fā)酵工藝，指導(dǎo)了有機(jī)酸（主要檸檬酸）行業(yè)，氨基酸（主要味精）行業(yè)的生產(chǎn)構(gòu)成體系。
抗生素發(fā)酵，是經(jīng)典發(fā)酵的代表。

所謂后抗生素時(shí)代，指進(jìn)入分子時(shí)代后，工程菌由于自身原因不適應(yīng)以抗生素發(fā)酵為指導(dǎo)，而自身發(fā)展了一種開發(fā)，生產(chǎn)，和評(píng)價(jià)體系。工程菌株的高精度控制發(fā)酵，代表了行業(yè)的最高水平。

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后抗生素的時(shí)代特點(diǎn)，有點(diǎn)和經(jīng)典發(fā)酵時(shí)代不同，在經(jīng)典發(fā)酵時(shí)代，抗生素工藝技術(shù)涵蓋了，指導(dǎo)了整個(gè)發(fā)酵行業(yè)，但后抗生素時(shí)代，分子技術(shù)和工程菌發(fā)酵技術(shù)，并不能代表整個(gè)行業(yè)。

它與經(jīng)典發(fā)酵，即抗生素工藝指導(dǎo)下的發(fā)酵，是同時(shí)存在的。 這一點(diǎn)，與抗生素時(shí)代不同。

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下面，以蛋白表達(dá)為例，大致闡述下后抗生素時(shí)代的技術(shù)過(guò)程，然后，再做一下對(duì)比。

先闡述大致工藝過(guò)程：

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蛋白表達(dá)的技術(shù)與工藝概述

在分子生物學(xué)角度講，找到或合成外源蛋白基因，構(gòu)建質(zhì)粒，并導(dǎo)入細(xì)胞以表達(dá)具有生物活性的折疊正確的蛋白，是一種成熟的常規(guī)技術(shù)。目前，包括酶，抗原，抗體，激素，其他小分子調(diào)節(jié)蛋白在內(nèi)的很多蛋白，都已經(jīng)用這種技術(shù)實(shí)現(xiàn)了工業(yè)化生產(chǎn)。在具體的工藝選擇上，歷史沿襲習(xí)慣和表達(dá)體系的選擇，對(duì)工藝穩(wěn)定性，成本，有巨大的影響。

目前，常用的蛋白表達(dá)系，有3個(gè)類別：

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1，大腸桿菌表達(dá)系。
大腸桿菌的遺傳背景十分清楚，代謝相對(duì)簡(jiǎn)單，發(fā)酵副產(chǎn)物少，在不是很嚴(yán)格的情況下，是表達(dá)蛋白的首選。通過(guò)按經(jīng)驗(yàn)選擇合適的菌株及合適的質(zhì)粒，既可以以包涵體的形式得到大量的目標(biāo)蛋白，又可以在細(xì)胞外得到可溶性蛋白，是常見的一種表達(dá)系。

2，酵母菌表達(dá)系。
用酵母做表達(dá)系，理由之一，也是遺傳背景清楚，而且，當(dāng)?shù)鞍追肿恿窟^(guò)小，不能形成包涵體時(shí)，或蛋白的二硫鍵過(guò)多，不易體外復(fù)性時(shí)，酵母菌就成了合適的選擇。另外，酵母對(duì)蛋白也會(huì)有一個(gè)簡(jiǎn)單的修飾，近似于高等動(dòng)物的蛋白糖基化過(guò)程。這樣，在合成在體液中發(fā)揮作用的蛋白，而且，又不能（技術(shù)水平限制）用動(dòng)物細(xì)胞時(shí)，就可以退而求其次的選用酵母菌表達(dá)。一般是用信號(hào)肽把蛋白導(dǎo)出細(xì)胞，在發(fā)酵液中以可溶性蛋白的形式存在。這也是一個(gè)常見的表達(dá)系。

3，動(dòng)物（或說(shuō)，人的）細(xì)胞表達(dá)系。
這種情況，在純度或毒性方面有較高要求的產(chǎn)品應(yīng)用。一般國(guó)外產(chǎn)品應(yīng)用較多，國(guó)內(nèi)還沒有用動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)蛋白實(shí)現(xiàn)商業(yè)化生產(chǎn)的報(bào)道。由于技術(shù)限制，國(guó)內(nèi)工業(yè)化生產(chǎn)用這個(gè)方法目前還有較大難度。

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這3種表達(dá)系，各自有自己的優(yōu)缺點(diǎn)。首先，在潛在的毒性影像方面講，由于和真核生物親緣關(guān)系太遠(yuǎn)，大腸桿菌就最不合適。其次是酵母菌。而在表達(dá)量和代謝控制成本上來(lái)講，酵母菌和動(dòng)物細(xì)胞又是差強(qiáng)人意的。現(xiàn)在，很多蛋白習(xí)慣性的選用酵母菌做表達(dá)系，就是因?yàn)樵缙谔崛〉鞍准夹g(shù)低下，而動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)又不過(guò)關(guān)的原因所致。目前，雖然提取工藝提高了，但作為蛋白這種高附加值產(chǎn)品，運(yùn)作成本集中在銷售而不是生產(chǎn)，所以，降低生產(chǎn)成本的訴求很低。站在降低開發(fā)難度的角度講，一方面，質(zhì)粒構(gòu)建和質(zhì)粒與菌株的匹配方面依賴大量經(jīng)驗(yàn)，另一方面，發(fā)酵工藝策略選擇與發(fā)酵工藝優(yōu)化又需要很大的投入，所以，技術(shù)開發(fā)部門沿用自己熟悉的，已經(jīng)積累了大量經(jīng)驗(yàn)的表達(dá)系，是合理的。

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不過(guò)，隨著分子技術(shù)進(jìn)一步的發(fā)展，分子技術(shù)進(jìn)入低附加值的產(chǎn)品領(lǐng)域又是必然的，降低生產(chǎn)成本就變的越來(lái)越必要了。

大腸桿菌表達(dá)系有兩種得到外源蛋白的方法：

1，緩慢的表達(dá)，得到可溶性蛋白，這種方法產(chǎn)量和酵母菌表達(dá)類似，與酵母菌比，不具有明顯的優(yōu)勢(shì)，一般是有做大腸桿菌傳統(tǒng)的研究機(jī)構(gòu)生產(chǎn)小分子蛋白的一種沿襲性做法。

2，使用T7啟動(dòng)子表達(dá)蛋白，這樣，高速的蛋白表達(dá)速率使蛋白來(lái)不及折疊，在細(xì)胞內(nèi)形成非水溶性的包涵體。最后目標(biāo)蛋白可以達(dá)到總細(xì)胞質(zhì)量的15%-25%，這樣，就為降低成本提供了一種可能。

不過(guò)，在使用T7啟動(dòng)子表達(dá)時(shí)，也存在兩個(gè)難點(diǎn)：

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1，蛋白的復(fù)性技術(shù)，如果形成可溶性蛋白，那利用（使用分子技術(shù)加載在目標(biāo)蛋白上）信號(hào)肽，只要過(guò)一遍柱子就能分離得到純度非常高的，具有生物活性的產(chǎn)品，而形成包涵體，對(duì)提取，復(fù)性就有較高的要求，特別是二硫鍵的存在，會(huì)對(duì)復(fù)性產(chǎn)生很大的影響。在目前國(guó)內(nèi)和國(guó)際流行技術(shù)看，并不是所有的蛋白都能在預(yù)定成本下復(fù)性的。

2，任何情況下，高產(chǎn)都是代謝網(wǎng)絡(luò)互相依賴與作用的結(jié)果。在如此高的表達(dá)量下，甚至細(xì)胞的形態(tài)都已經(jīng)發(fā)生很大變化，正常代謝受到嚴(yán)重干擾，以至于放大時(shí)，搖瓶工藝對(duì)發(fā)酵工藝幾乎沒有任何參考價(jià)值。發(fā)酵工藝策略的選擇將直接依賴于工程人員在生化，生理水平對(duì)菌株的理解，而匱乏可資參考的數(shù)據(jù)資料。發(fā)酵工藝的優(yōu)化要離開搖瓶經(jīng)驗(yàn)在發(fā)酵罐上逐步進(jìn)行，這樣，整個(gè)發(fā)酵工藝的確立就需要比想象中要大得多的人員與時(shí)間的投入。

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另外，再說(shuō)一下糖基化的問(wèn)題。

在動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)合成的折疊正確的蛋白，在分泌入體液前會(huì)有一個(gè)糖基化的過(guò)程，加上一個(gè)糖鏈就不會(huì)很快被蛋白酶當(dāng)做折疊錯(cuò)誤的蛋白水解掉。但是以微生物為表達(dá)系表達(dá)的蛋白，不具有動(dòng)物細(xì)胞的修飾過(guò)程，用大腸桿菌表達(dá)的目標(biāo)蛋白，很快會(huì)在血液中被降解。解決或回避這個(gè)問(wèn)題，有兩種方法：

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1，用動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)，一般，是用癌化的人類細(xì)胞。由于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)要求過(guò)高，在國(guó)外比較昂貴的醫(yī)藥中有應(yīng)用，國(guó)內(nèi)不常見。

2，由于酵母菌也有一個(gè)對(duì)蛋白的粗略的修飾過(guò)程，可以用酵母菌表達(dá)目標(biāo)蛋白。這個(gè)技術(shù)，國(guó)內(nèi)國(guó)外都在用，可以是一個(gè)權(quán)宜之計(jì)。主要難點(diǎn)集中在對(duì)合適菌株的分子水平的改造，以達(dá)到盡可能接近滿意的修飾效果。