豬病實驗室常規(guī)診斷技術（連載）之六、常規(guī)病毒學實驗技術

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六、常規(guī)病毒學實驗技術

（一）病毒的培養(yǎng)

實驗動物：家兔、小白鼠、大白鼠、豚鼠、倉鼠
主要用于：
①
分離病毒，并借助感染范圍試驗鑒定病毒
②
培養(yǎng)病毒，制造抗原和疫苗
③
測定各毒株之間的抗原關系，（用實驗動物作中和試驗和交叉保護實驗）
④
制備免疫血清和單克隆抗體
⑤
作病毒感染的實驗研究，包括病毒毒力測定、建立病毒病動物模型等
注意：選擇對目的病毒敏感的實驗動物品種品系，以及適宜的接種途徑和劑量。

雞胚
（一）條件要求

SPF雞、孵化溫度38-39℃，濕度40-70%，通風。新鮮受精卵：產下后不超過10天并保存10℃左右。
（二）優(yōu)點
組織分化程度低，可選擇不同的日齡和接種途徑，病毒易于增殖，感染病毒的組織和液體中含有大量病毒，容易采集和處理，而且來源充足，設備和操作簡便易行。
（三）接種途徑
1．
絨毛尿囊膜接種（10-12日齡雞胚）

主要用于痘病毒和皰疹病毒的分離和增殖。
1）
方法一（造人工氣室）
①
在胚胎附近近氣室處，選擇血管較少的部位，用電烙器在卵殼上烙一個直徑約3-4mm的烤焦圈。
②
用碘酊和酒精消毒后，小心用刀尖撬起卵殼，造成卵窗。
③
在氣室端中央鉆一個小孔。
④
用針尖挑破卵窗中心的殼膜，切勿損傷其下的絨毛尿囊膜。
⑤
滴加滴生理鹽水于刺破處，用橡皮乳頭緊貼于氣室中央小孔上吸氣，造成氣室內負壓，使卵窗部位的絨毛尿囊膜下陷而形成人工氣室，此時可見滴于殼膜上的生理鹽水迅速滲入。
⑥
用1ml注射器滴入2-3滴接種物于絨毛尿囊膜上。
⑦
用透明膠紙封住卵窗，或用玻璃紙蓋于卵窗中，周圍涂上熔化的石蠟密封，氣室中央的小孔用石蠟密封。
⑧
雞胚橫臥于卵箱中，不許翻動，保持卵窗向上。
2）方法二
①
在氣室端的卵殼上開約1.5×1.5cm的口。
②
用滅菌眼科鑷子撕去一小片內殼膜。
③
滴入接種物。
④
用透明膠紙封閉開口。
2．
尿囊腔接種（10-11日齡）

用于正粘病毒和副粘病毒（NDV）
1）
畫出氣室和胚位
2）
在氣室接近胚位處涂沫碘酊和酒精消毒
3）
用鋼錐穿一小孔
4）
將注射器針頭沿此小孔插入0.5-1cm，注入接種物
5）
用石蠟封口，置孵卵箱中孵育，每天翻卵1-2次
3．
卵黃囊接種（6-8日齡）

主要用蟲媒病毒以及鸚鵡熱衣原體和立克次氏體等的分離和增殖。
1）
畫出氣室和胚位
2）
垂直放置在卵座上，用碘酊和酒精消毒氣室外端
3）
以鋼錐在氣室中央錐一小孔
4）
將注射器針頭沿此小孔插入3cm，注入接種物
5）
用石蠟封口，置孵卵箱中孵育，每天翻卵1-2次
4．其它接種途徑

羊膜腔接種，正粘病毒和副粘病毒

靜脈接種，藍舌病毒

腦內接種，狂犬病毒
組織培養(yǎng)
原代細胞：應用胰酶等分散劑將動物組織消化成單個細胞懸液，適當洗滌以后，加入營養(yǎng)液，通常即可使其貼附于玻璃壁上，并生長增殖。
繼代細胞：將原代細胞從玻璃瓶壁上消化下來再作培養(yǎng)。
傳代細胞：由于遺傳突變或者在理化學物質和致瘤病毒的作用下，組織培養(yǎng)細胞中有時出現(xiàn)惡性變細胞，也就是癌變細胞，這種病變細胞具有很高的增殖勢能，而且?guī)缀蹩梢詿o限地傳代。
原代細胞培養(yǎng)（以雞胚成纖維細胞為例）
1）
在無菌條件下采取9-10日齡雞胚，置滅菌平皿中，除去頭（或僅除去喙和眼）、爪和內臟，并剪成塊。
2）
用Hanks液，充分沖洗后移入大號青霉素瓶或其它廣口瓶中，用眼科剪剪成1mm3大小的碎塊。
3）
加入Hanks液，充分沖洗，并靜置幾分鐘，待組織塊下沉，吸棄上層液體，再加洗液。如此反復沖洗2-3遍。
4）
于沉淀組織塊內加入約4倍量的0.25%胰酶，并調整pH至7.6-7.8，振蕩混勻后置37℃水浴中感作30分鐘，每10分鐘輕輕搖動一次。
5）
取出，小心吸棄上層胰酶溶液，用洗液輕洗2次后，用大口徑吸管反復吹打，使細胞游離。
6）
用雙層或三層紗布過濾，收集濾液于離心管中，以600rpm離心沉淀5-10min，吸棄上清液，按每個雞胚5ml的量，加入營養(yǎng)液，并用吸管反復吹打，直至形成均勻的細胞懸液。
7）
細胞計數(shù)（培養(yǎng)時，使細胞達到5×105個/ml）
取細胞懸液0.5ml+2ml 0.1%結晶紫——構椽酸（0.1mol/L）溶液，室溫或37℃溫箱中5-10分鐘，充分振蕩后進行計數(shù)。
按白細胞計數(shù)法計算4角4個大方格內的細胞總數(shù)（N）。每ml懸液中的細胞數(shù)（n）=N/4×10000×K（稀釋倍數(shù)）。
傳代細胞系培養(yǎng)
優(yōu)點：1)可以無限的傳代。

2)不少細胞系對病毒很敏感。

3)某些傳代細胞系能在懸浮培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，適合病毒抗原的大量生產。

4)生長旺盛，繁殖快速，對營養(yǎng)條件不苛刻。
缺點：在傳代過程中遭到支原體和病毒的污染。
細胞分散劑
1．
胰酶
使精氨酸或賴氨酸的羧基和其他氨基酸的氨基之間的多肽鏈發(fā)生水解，導致細胞間質水解而使細胞或組織塊消化為分散的單個細胞。
2．
乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）
營養(yǎng)液
1．
人工綜合營養(yǎng)液
氨基酸、糖類、無機鹽類、維生素、輔酶、嘌呤、嘧啶、輔助生長因子。
2．
血清
1）
動物血清中含有細胞生長所必須的各種營養(yǎng)因子。
2）
促進細胞的貼壁和生長。
3）
具有很強的酸堿緩沖作用。

（二）病毒感染力的滴定

LD50，EID50，TCID50
（TCID50的測定）
1．
在青霉素瓶中將病毒作連續(xù)10倍的稀釋，從10-1— 10-10。
2．
將稀釋好的病毒接種到96孔微量培養(yǎng)板中，每一稀釋度作8孔，每孔接種100ul。
3．然后在每孔加入細胞懸液100ul，使細胞量達到3×105個/ml。
4．設正常細胞對照，正常細胞對照作兩縱排。
5．逐日觀察并紀錄結果，一般需要觀察5-7天。
6．結果的計算，按Reed-Muench兩氏法或Karber法進行。
TCID50的計算方法：
1．Reed-Muench法

file:///C:/DOCUME~1/ADMINI~1/LOCALS~1/Temp/msohtml1/01/clip_image001.gif病毒液 稀釋度	出現(xiàn) CPE孔	不出現(xiàn)CPE孔	累計 出現(xiàn)CPE孔 不出現(xiàn)CPE孔		出CPE的孔 所占的%
10-1	8	0	27	0	100（27/27）
10-2	8	0	19	0	100（19/19）
file:///C:/DOCUME~1/ADMINI~1/LOCALS~1/Temp/msohtml1/01/clip_image002.giffile:///C:/DOCUME~1/ADMINI~1/LOCALS~1/Temp/msohtml1/01/clip_image003.gif10-3	7 3 1	1 5 7	11	1	91.6(11/12)
10-4			4	6	40（4/10）
10-5			1	13	0.7（1/13）
10-6	0	8	0	21	0（0/21）

高于50%的百分數(shù)-50%

91.6-50
file:///C:/DOCUME~1/ADMINI~1/LOCALS~1/Temp/msohtml1/01/clip_image004.giffile:///C:/DOCUME~1/ADMINI~1/LOCALS~1/Temp/msohtml1/01/clip_image005.gif距離比例=
=
=0.8

高于50%的百分數(shù)-低于50%的百分數(shù)
91.6-40
lgTCID50=距離此例X稀釋度對數(shù)之間的差+高于50%病變率的稀釋度的對數(shù)

=0.8×(-1)+(-3)=-3.8

TCID50=10-3.8
2. Karber法
病毒液稀釋度
出現(xiàn)CPE孔的比率
10-1

8/8=1
10-2
8/8=1
10-3


7/8=0.875
10-4


3/8=0.375
10-5


1/8=0.125
10-6


0/8=0
lgTCID50=L-d(s-0.5)
L: 最高稀釋度的對數(shù)
D：稀釋度對數(shù)之間的差
S：陽性孔比率總和
lgTCID50=-1-（-1）×(3.375-0.5)

=-3.875
TCID50=10-3.875/0.1ml

（三）病毒中和試驗

一、原理
抗體與相應的病毒粒子特異性地結合，使后者喪失感染能力。
二、用途
1. 疾病診斷。
2. 病毒分離株的鑒定。
3. 不同病毒株的抗原關系研究。
4. 疫苗免疫原性的評價。
5. 免疫血清的質量評價。
6. 測定實驗動物血清中是否存在抗體等。
三、分類
（一）終點法中和試驗
1. 固定病毒——稀釋血清法。
1)
將測好TCID50的病毒稀釋成200個TCID50的病毒懸液。
2)
在96孔微量培養(yǎng)板中將血清作連續(xù)倍比稀釋（具體方法是在96孔板中先加入50ul生長液，再加50ul待檢血清，混勻后，吸50ul至下一孔，如此下去。一直到1:256），每個稀釋度作4孔。
3)
在上述各孔內加入50ul稀釋好的病毒液，混勻后放入37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中作用45min-60min。
4)
同時設待檢血清毒性對照，陰、陽性血清對照，病毒對照和正常細胞對照。
5)
感作完成后每孔加入100ul細胞懸液，放37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，逐日觀察并記錄結果。

6)
結果計算，按Reed-Muench兩氏法或Karber法進行。

Reed-Muench計算方法：

血清稀釋度	CPE孔數(shù)	無CPE孔數(shù)	累 計 CPE孔數(shù) 無CPE孔數(shù) 保護率（%）
1:4（10-0.6）	file:///C:/DOCUME~1/ADMINI~1/LOCALS~1/Temp/msohtml1/01/clip_image006.gif0	file:///C:/DOCUME~1/ADMINI~1/LOCALS~1/Temp/msohtml1/01/clip_image007.gif4	0	9	100
1:16（10-1.2）	1	3	1	5	83
1:64（10-1.8）	2	2	3	2	40
1:256（10-2.4）	4	0	7	0	0
1:1024（10-3.0）	4	0	11	0	0

高于50%的保護率-50%

file:///C:/DOCUME~1/ADMINI~1/LOCALS~1/Temp/msohtml1/01/clip_image008.gif距離比例=


高于50%的保護率—低于50%的保護率



83-50
file:///C:/DOCUME~1/ADMINI~1/LOCALS~1/Temp/msohtml1/01/clip_image009.gif

=
= 0.7

83-40
高于50%的保護率血清稀釋度的對數(shù)+距離比例×稀釋系數(shù)的對數(shù)
=-1.2+0.77×(-0.6)
=-1.66

-1.66的反對數(shù)=1/46
即：1:46稀釋的待檢血清可保護50%的組織培養(yǎng)細胞免于出現(xiàn)CPE。
2. 固定血清——稀釋病毒法。
1) 將病毒作連續(xù)10倍稀釋
1）
將稀釋好的病毒接種96孔板，每個稀釋度接種一縱排共8孔，每孔50μl，做兩塊板子，在一塊板子的每孔加入50μl待檢血清（試驗組），另一塊板子的每孔加入50μl正常血清（對照組），混合后置37℃
5%CO2培養(yǎng)箱作用1h。
2）
然后在每孔中加入100μl細胞。
3）
另外還設兩縱排正常細胞對照。
4）
置37℃
5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，逐日觀察并記錄結果。
5）
分別計算每組病毒的TCID50，然后計算血清的中和指數(shù)。

試驗組TCID50
file:///C:/DOCUME~1/ADMINI~1/LOCALS~1/Temp/msohtml1/01/clip_image010.gif中和指數(shù)=

對照組TCID50
(二) 蝕斑（痘斑）減數(shù)試驗
1、蝕斑技術
病毒蝕斑：又稱空斑，指病毒在已長成的單層細胞上形成的局限性病灶。
原理：將病毒懸液作連續(xù)的10倍稀釋，隨后各取定量，接種于已經長成單層的敏感細胞上，并覆蓋中性紅瓊脂糖，待其出現(xiàn)蝕斑后計數(shù)，即可算出每毫升病毒懸液中所含的蝕斑單位。
用途：①用于病毒純化；②測定病毒懸液中感染病毒的含量。
2、蝕斑減數(shù)試驗

將病毒——正常血清混合物以及病毒——待檢血清混合物分別接種到單層細胞上，隨后覆蓋營養(yǎng)瓊脂或甲基纖維素，進行蝕斑測定，比較病毒——正常血清組和病毒——待檢血清組產生的蝕斑數(shù)，兩者的差數(shù)表示待檢血清的中和能力。以試驗組的蝕斑數(shù)比對照組減少50%作為判定依據(jù)，血清稀釋度就是其蝕斑減數(shù)試驗效價。
(三) 交叉保護試驗


先將實驗動物進行主動免疫或被動免疫，然后以待檢病毒進行攻擊，根據(jù)實驗動物被保護的情況，判定待檢V的種類或型別。其缺點是試驗周期太長，并且需要大量的實驗動物。
用途：（1）應用已知V鑒定未知V

（2）應用已知免疫血清鑒定未知V

（3）應用已知V鑒定未知血清

（四）病毒的分離和鑒定
病毒材料的注備
1．
腦、肝、肌肉等器官或組織

充分研磨后加入5倍量的Hank’s液（內含P.S各200V/ml）反復凍融三次。2000rpm 10min，取上清作接種物。
2．
鼻液、乳汁、膿汁等分泌物或滲出物

用內含青、鏈霉素100u/ml的Hank’s液，將其稀釋3-5倍，充分混勻懸浮后，置4℃冰箱內感作2-4h或過夜，200rpm 10min取上清作接種物。
3．
咽喉拭子或鼻拭子

仔細用棉拭子擦拭咽喉部，并迅速將其泡入盛有2-5ml Hank’s液的（200-500u/ml P.S）試管內，充分涮洗棉拭子，反復凍融3-5次，收集液體部分，2000rpm 10min，收集上清作接種物。
4．
糞便

用含100u/ml P.S的Hank’s液作10-20倍稀釋，4℃感作4h，2000rpm 10min取上清作接種物。
5．
無菌的體液或雞胚液

直接接種用。

接種方法
1．
實驗動物
2．
雞胚
目前常用雞胚分離的病毒有正粘V、副粘V、痘V、腦炎V及引起禽類疫病的其它許多V。
3．
組織培養(yǎng)細胞。

病毒增殖的判定
1．
細胞病變（CPE）
2．
抗原的測定
3．
中和試驗
4．
病毒間的干擾現(xiàn)象
file:///C:/DOCUME~1/ADMINI~1/LOCALS~1/Temp/msohtml1/01/clip_image011.gif乙型腦炎V
脊髓灰質炎V
file:///C:/DOCUME~1/ADMINI~1/LOCALS~1/Temp/msohtml1/01/clip_image012.gif流感V
西方馬腦炎V
file:///C:/DOCUME~1/ADMINI~1/LOCALS~1/Temp/msohtml1/01/clip_image013.giffile:///C:/DOCUME~1/ADMINI~1/LOCALS~1/Temp/msohtml1/01/clip_image012.gif
豬傳染胃腸炎
牛病毒性膜炎
粘膜病V
5．
電子顯微鏡觀察
6．
實驗動物或雞胚接種

病毒感染力的滴定

LD50、EID50、TCID50

病毒理化學特性的測定
1．
病毒核酸型鑒定（藥物抑制試驗）
FUDR、IVDR、BRUDR
原理：FUDR、ICDR、BRUDR是嘧啶的鹵化物，進入cell后發(fā)生磷酸化，摻入新合成的DNA以代替胸腺嘧啶產生至功能分子，從而抑制DNA的合成。常用濃度為50ug/ml。
2．脂溶劑敏感性試驗
1）
乙醚敏感試驗

取同批病毒分裝于兩個青霉素瓶中，每瓶16ml，在其中1瓶加入麻醉用乙醚，使終濃度為20%，兩瓶均用橡皮塞塞緊后，置4℃凍箱內作用24h，其間不時振蕩，隨后以2000rpm離心20min。已加乙醚的小瓶，用毛細吸管吸取病毒液，移入另一小瓶內，適當吹打，使殘余乙醚揮發(fā)殆盡，然后滴定兩組病毒的TCID50。
2）
氯仿敏感性試驗

向病毒液內加入分析純氯仿，使其終濃度為4.8%，置4℃振蕩混合10min。隨后500rpm 5min，然后吸取上層液體，滴定病毒TCID50。對照組病毒加入終濃度為4.8%的生理鹽水，同樣處理和滴定。
3．胰蛋白酶敏感試驗
脊髓灰質炎V、豬傳染性胃腸炎V對胰酶有較強的抵抗力，痘V、呼腸孤V、皰疹V易被胰酶滅活。取病毒液兩瓶，每瓶1ml,在其中1瓶加入1ml 1%的trypsin，使終濃度為0.5%，另一瓶加入1ml 1640（培養(yǎng)基），用橡皮塞塞緊瓶口，將小瓶倒轉幾次，使其充分混合，置37℃1h，隨即加入滅活犢牛血清8ml，充分混合，終止胰酶的作用。最后滴定兩瓶V的TCID50。
4．
耐酸性試驗

pH3.0 2h or pH5.0 1h

取等量病毒液兩瓶，用0.1mol/L HCL將1個小瓶中的病毒液的pH調至3.0(or 5.0)，并在另一個小瓶內加入相同于用酸量的培養(yǎng)基作為對照，置37℃水溶或室溫中感作2h(or 1h)，再用5.6%NaHCO3溶液將pH調回至7.2左右，對照組再加緊入相同于NaHCO3量的培養(yǎng)基，測定兩者的TCID50。
5．
耐熱性試驗

將病毒液分成等量的11小瓶，其中4小瓶分別置50℃、60℃、70℃、80℃水溶中1h，另6瓶置50℃水浴中分別感作5、10、15、30、60和180min，隨后測定每瓶V的感染X。
6．
病毒粒子大小測定
1)電子顯微鏡直接觀察（透射電鏡、磷鎢酸負染）
2)超速離心沉淀
3)濾過試驗
取澄清的病毒液20ml，留出1ml作為對照，將剩余的19ml病毒液在正壓下依次通過孔經為450nm、225nm、100nm和50nm的各級微孔，每通過一種孔徑的濾膜就吸取1ml濾液用為樣品，并將剩余的濾液通過一次濾膜。最后測定原病毒液以及各級濾液的TCID50。

病毒液種類
TCID50/0.1ml

濾前病毒液


10-6.75

450nm孔徑液
10-6.23

225nm孔徑液
10-5.78

100nm孔徑液
10-4.50


50nm孔徑液
10-0.50
免疫——血清學檢查
目的：①新分離毒株的種類及型別的鑒定。

②檢測發(fā)病動物體液中的Ab，或進一步比較動物急性發(fā)病期和恢復期血清中的Ab效價，了解病毒性Ab是否有明顯的增長，從而判定V感染的存在。
（一）
中和試驗
1．
終點法中和試驗
固定病毒——稀釋血清法中和試驗
固定血清——稀釋病毒法中和試驗
2．
蝕斑（痘斑）減數(shù)試驗
1）
蝕斑技術
病毒蝕斑，又稱空斑，指病毒在已長成的單層細胞上形成的局限性病灶。
原理：將病毒懸液作連續(xù)的10倍稀釋，隨后各取定量，接種于已經長成單層的敏感細胞上，并覆蓋中性紅瓊脂糖，待其出現(xiàn)蝕斑后計數(shù)，即可算出病毒懸液中每毫升所含的蝕斑單位。
用途：①用于病毒純化；②測定病毒懸液中感染病毒的含量。
2）
蝕斑減數(shù)試驗

將病毒——正常血清混合物以及病毒——待檢血清混合物分別接種到單層細胞上，隨后覆蓋營養(yǎng)瓊脂或甲基纖維素，進行蝕斑測定，比較病毒——正常血清組和病毒——待檢血清組產生的蝕斑數(shù)，兩者的差數(shù)表示待檢血清的中和能力。以試驗組的蝕斑數(shù)比對照組減少50%作為判定依據(jù)，血清稀釋度就是其蝕斑減數(shù)試驗效價。
3．
交叉保護試驗

先將實驗動物進行主動免疫或被動免疫，然后以待檢病毒進行攻擊，根據(jù)實驗動物被保護的情況，判定待檢V的種類或型別。其缺點是試驗周期太長，并且需要大量的實驗動物。
用途：（1）應用已知V鑒定未知V；

（2）應用已知免疫血清鑒定未知V；

（3）應用已知V鑒定未知血清。

（五） 凝集試驗

定義：

顆粒性抗原（如細菌、紅細胞等）或表面載有抗原的顆粒狀的物質（如聚苯乙烯膠乳、紅細胞、炭素顆粒等），與相應抗體在電解質存在下凝集成團的試驗。
分類
file:///C:/DOCUME~1/ADMINI~1/LOCALS~1/Temp/msohtml1/01/clip_image014.gif
直接凝集試驗：顆粒狀Ag與相應Ab所發(fā)生的凝集反應。（布氏桿菌）

間接凝集試驗（被動凝集試驗）：可溶性抗原吸附到載體顆粒表面，與相應抗體所發(fā)生的凝集反應，可以證明相應抗體的存在并測定效價。反相問接凝集試驗（反向被動凝集試驗）：將抗體吸附到顆粒表面與相應抗原所發(fā)生的凝集反應。
file:///C:/DOCUME~1/ADMINI~1/LOCALS~1/Temp/msohtml1/01/clip_image015.gif
間接血凝試驗

膠乳凝集試驗

炭凝集試驗
間接凝集試驗

皂土凝集試驗

脂質體凝集試驗
file:///C:/DOCUME~1/ADMINI~1/LOCALS~1/Temp/msohtml1/01/clip_image016.gif
間接凝集抑制試驗：先將被檢的抗體（或抗原）與已知的抗原（或抗體）作用后，再與抗體（或抗原）致敏的顆粒時行反應。

反向凝集抑制試驗

間接凝集試驗的優(yōu)點：快速、簡便、特異、敏感
間接血凝試驗（IHA）（PHA）

口蹄疫、豬瘟、弓形體、胸膜肺炎、衣原體

反向IHA：FMDV、水皰病病毒Ag、豬傳染笥胃腸炎病毒Ag、小鵝瘟病毒Ag等。
紅細胞作為載體的優(yōu)點：
1．
來源廣泛，容易取得。
2．紅細胞表面幾乎可以吸附任何一類的Ag或Ab，如蛋白質、糖蛋白、核蛋白以及多糖等。
3．具有天然的均一性，比其它許多載體都更容易標準化和規(guī)格化。
缺點：容易破裂、難于保存
IHA的優(yōu)點：
①敏感性高、特異性強、重復性和穩(wěn)定性好，操作簡便、反應迅速。
②既可定性又可半定量，而且試劑價格低廉，不需要特殊、復雜的設備。
注意：影響紅細胞凝集的因素很多：紅細胞的來源，致敏條件、操作技術、標本中的雜質、細菌污染和類屬Ag常引起非特異性凝集反應。
1．
紅細胞的選擇和保存
選擇：許多種類動物的紅細胞，包括人的0型紅細胞都可用，但用得最多的是綿羊紅細胞。
保存：用玻璃珠脫纖法采集或用肝素抗凝。
②無菌的紅細胞在4℃冰箱中可保存3-4天。
②采血時加等量氏液和適量抗生素，4℃保存2周，但這樣紅細胞致敏時容液自凝。
2．
紅細胞的醛化
醛化劑：甲醛、戊二醛、丙酮醛、丙酮醛—甲醛雙固定、戊二醛—丙酮醛雙固定。
1）
無菌采取綿羊靜脈血，加至紅細胞保存液內，4℃保存?zhèn)溆谩?/font>
2）
取紅細胞懸液1份，加入10倍量0.1mol/L、PH7.2磷酸緩沖液（PH7.2PB），洗5遍，并以該液配成8%紅細膩懸液。
3）
紅細胞懸液1份+3%丙酮醛液等量，24左右的室溫中用電磁攪拌器緩慢攪拌17h。PH7.2PB配成8%懸液，——丙酮醛固定紅細胞懸液。
4）
丙酮醛固定紅細胞懸液1份+等量3%甲醛液，如上攪拌17hr。
5）
再以PH7.2PB液洗5遍，最后用內含0.1%疊氮鈉的ph7.2PB配成20%的紅細胞懸液，分裝后置4℃冰箱內保存，可用2個月—雙醛化紅細胞懸液。
3．紅細胞的鞣化
作用： 可增加紅細胞吸附蛋白質的能力，新鮮紅細胞用1：200000濃度的鞣酸，醛化紅細胞用1：100000濃度的鞣酸。
程序： 取紅細胞，用PH7.2PB洗4—5遍，并用同液配成2.5%懸液，同時以PH7.2PB臨時配制1：200000優(yōu)質鞣酸，將其與紅細胞懸液等量混合，37℃水浴咸作15min。取出后用ph7.2PB洗一次，再用PH7.2pB配成20%紅細胞懸液。
4．致敏紅細胞的制備：
1）
抗體致敏紅細胞

取20%鞣化或未鞣化的雙醛化紅細胞懸液1ml，離心沉淀，棄去上清液，將沉淀紅細胞重新懸浮于0.1mol/L.PH3.5~4.0醋酸緩沖液10ml中，加入等量的提純IgG液（每毫升需含IgG100~300g）置37℃水浴中咸作2-4h，每15-20分釧用吸管輕輕吹吸混合2-3次。以ph7.2PB洗5遍，再將沉淀紅細胞用1%滅活免血清鹽水配成0.8%懸液備用。—— Ab致敏紅細胞懸液。
2）
抗原致敏紅細胞

取PBS（PH6.4）4ml病毒抗原1ml，2.5%鞣酸化紅細胞懸液1ml，混勻后，置室溫下振蕩結合30—60min（隨病毒Ag種類不同）或37℃水浴30-45min，其間適當振搖。隨后以1500rpm離心沉淀10min，并用2倍量的PH7.2PB(內含1%滅活兔血清)洗2遍后，配成1%的致敏紅細胞懸液供試驗用。以病毒致敏的紅細胞懸液應立即使用。4℃冰箱保存，不宜超過2天。
※致敏紅細胞的保存：用1%兔血清鹽水或0.4%明膠緩沖液洗滌，并用其配成2.5%懸液保存?zhèn)溆?。長期保存：用含1%糖和4%兔血清的生理鹽水，將致敏紅細胞配成10%懸液，然后于真空中冷凍干燥。
乳膠凝集試驗
乳膠的預處理

取空白乳膠用PBS（PH7.4）配成2%溶液，加入10%的胰蛋白酶液，使其終濃度為1%，于56℃水溶作用18-24h，其間搖動幾次，置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩谷槟z穩(wěn)定并減少非特異性凝集。（離心上清，將沉淀用PBS懸浮配成2%乳膠溶液）
乳膠的致敏
1．

將濃縮的病毒抗原作倍比稀釋（PBS），加入等量的2%空白乳膠中（逐滴加入，邊加邊搖動）。37℃作用15-30min。
2．

加入10%牛血清白蛋白，使終濃度為1%，混合均勻，37℃ 15-30nin，或2h，即得乳膠抗原。

（六）標記抗體技術（免疫標記技術）

原理： 抗體能追蹤抗原，在抗原所在部位與之結合，一旦結合后就不易洗脫。但此種結合反應肉眼不易察出。有一些物質在超微量時，即能用某種特殊理化因素將其檢測出來。如將這些構標記在抗原或抗體分子上，就能利用調換體與原特異結合的特性，檢測抗原或抗體，即免疫標記技術。
file:///C:/DOCUME~1/ADMINI~1/LOCALS~1/Temp/msohtml1/01/clip_image017.gif
熒光抗體技術（免疫熒光技術）
分類：
酶標記抗體技術（免疫酶技術）

同位素標記抗體技術（放射免疫測定技術）

鐵蛋白標記抗體技術
免疫熒光技術
基本方法和原理
1．
直接法

將標記的特異熒光抗體，直接加在Ag標本上，經一定溫度和時間的染色，用水洗去來參加反應的多余熒光抗體，室溫干燥后封片，鏡檢。優(yōu)點：方法簡便，非特異熒光染色因素少。缺點：不夠敏感，且一種標記抗體只能檢測一種Ag。
2．
間接法

既可檢查抗體，也可檢查抗原。
1）
檢查抗原

用已知未標記的特異抗體（一抗）與抗原標本進行反應，用水洗去未反應的抗體，再用標記的抗體（二抗）與抗原標本反應，使之形成抗原一抗體——抗抗體復合物，再用水洗去未反應的標記抗抗體，干燥封片后鏡檢。
2）
檢查Ab

Ab標本為已知的，待檢血清為第一抗體，其它步驟同上。缺點：但特異性較差?？赡苁情g接法的中間層可結合更多的標記抗體所致。優(yōu)點：敏感性高，且標記一種抗體球蛋白抗體，可用于多種抗原，抗體系統(tǒng)的檢查。既可檢測Ag，也可檢測Ab。
3．
補體法

應用補體結合反應的原理，用熒光素標記抗補體抗體，鑒定未知Ag或未知Ab。先將未標記的Ab和補體加在Ag標本上，使其發(fā)生反應，隨后再加標記抗體抗體，使之形成Ag— Ab—cb抗補體復合物。缺點：特異性較差。優(yōu)點：敏感性高。標記一種抗體補體Ab，可用于各種Ag—Ab系統(tǒng)的檢查（可用于各種動物）
間接法：雙層法、混合法、三層法。補體法：抗體一抗補體法、異屬補體結合法。涂片壓印片、冰凍切片、石蠟切片、組織培養(yǎng)物、可溶性Ag標本（醋酸評維素膜）。
放射免疫測定技術
原理： 用放射性同位素標記已知的Ab或Ag，用以檢測被檢材料中Ag 或Ab。隨后根據(jù)Ag—Ab復合物中的同位素放射性強度進行定性或定量的測定。優(yōu)點：敏感性和特異性都很強。缺點：射線污染。
分類和操作原理：
（一）
液相放射免疫測定
1．
直接法（Ag、Ab）

用放射性同位素標記病毒Ag或Ab。檢測相應的Ab 或Ag。主要同于顆粒性物質，如懸浮細胞內病毒抗原的初步檢測，檢測Ag時，通過超速離心將Ag—Ab復合物沉淀下來，分別檢測沉淀物和上清液中的放射性強度，檢測Ab時，在Ab、Ag感作以后，再加入適當濃度（40-50%飽和度）的硫酸銨，叫Ag—Ab復合物鹽析沉淀，而Ag仍處于溶解狀態(tài)。
2．
間接法（主要用于病毒抗體的檢測）

被檢血清+ Ag+二抗離心沉淀
3．
競爭法（主要用于病毒抗原的檢測）

被檢抗原+標定濃度的特異抗體，混合咸作一定時間再加入標定量的放射性同位素標記抗原—離心沉淀。
（二）
固相放射免疫測定（聚苯乙烯小管或微量滴定板上，或者用溴化氫、二醛等將Ab偶聯(lián)或共價聯(lián)結于瓊脂糖珠或纖維素等表面）
1．
夾心法

Ab+待檢Ag+標記Ab
2．
夾心間接法，與上法相比，敏感性更強。

Ab包被+待檢Ag+另一動物的抗病毒Ab+同位素標記的抗第二次Ab的抗抗體
3．
競爭法

Ab包被+待檢抗原+標記Ag
file:///C:/DOCUME~1/ADMINI~1/LOCALS~1/Temp/msohtml1/01/clip_image009.gif
兩者同時加入or待檢Ag先加
4．
阻斷試驗法

Ab包被+已知Ag+被檢血清+同位素標記的Ab。
（三）
放射免疫自顯影

用同位素標記Ab or Ag，然后進行瓊脂擴散試驗或免疫電泳對流免疫電脈，檢測相應的Ag or Ab。擴散或電泳完畢后，將瓊脂板置于鹽水和ddH2O中充分浸泡，除去未結合的標記Ab或Ag。干燥后，覆蓋X光膠片，置暗室中曝光1-2天。經過顯影和定影，即可在X光膠片上顯示特異的沉淀線。
免疫酶技術
file:///C:/DOCUME~1/ADMINI~1/LOCALS~1/Temp/msohtml1/01/clip_image018.gif免疫酶染色法
抗酶抗體法
放大抗體法：同時使用酶標記抗體和抗酶抗體
1．
酶標記抗體法
1）
直接法

用酶標記的特異性Ab，直接檢測病毒或病毒Ag。在將含有uirus或virus Ag的組織和細胞標本固定的消除其中的內源性酶以后，應用酶標記Ab直接處理，隨后滴加底物顯色，直接鏡檢。
2）
間接法

將含有V或V Ag的組織或細胞標本，先用特異性V Ab處理，充分涮洗后，再用酶標記的抗體處理，使其形成Ag-Ab-酶標記抗體復合物，最后滴加底物，鏡檢。
2．
抗酶抗體法

不需進行酶的標記，比前都簡便和靈敏
1）
免疫球蛋白橋法
搭橋：用二抗（如抗兔IgG的抗體）將抗體和已結合在病毒抗原上的同種動物（兔）特異性Ab連接起來。

加酶，形成Ag+Ab+抗抗體+抗酶抗體+酶加底物顯色、鏡檢。
2）
可溶性酶——抗酶復合物法（PAP）
3）
雜交抗體法

將來自同種動物的抗IgG抗體（或其Fab碎片）與抗酶抗體（或其Fab碎片）結合起來，使之成為一種具有抗IgG和抗酶雙重活性的雜交抗體。再用這種雜交抗體進行免疫酶染色。Ag+Ab+雜交Ab+酶
（一）
免疫酶測定法

固相免疫酶測定法：利用固相載體，以化學的或物理的方法將Ag或Ab聯(lián)接于其上，制成免疫吸附劑，隨后進行免疫酶測定。

均相免疫酶測定法：不需將游離的和結合的酶標記物分離，也不需要載體，直接從溶液中測定結果。
1．
固相免疫酶測定法

根據(jù)固相載體的種類和免疫吸附劑的制備方法。分為兩類：、
1）
酶聯(lián)免疫吸附試驗或測定法（Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）。
①
間接法，用Ag包被板子+Ab（未知）+抗Ab+酶底物顯色
②
雙抗體夾心法，用于檢測Ag。Ag+Ag（未知）+抗Ab+酶底物顯色
③
競爭法：（測定Ag）

利用酶標記Ag和未標記Ag共同競爭有限量的Ab，測定樣品中的Ag。需同時微只加酶標記Ag的系統(tǒng)作對照。Ab+待檢Ag和酶標記Ag（與可先加待檢樣品，稍后再加酶標記Ag）。對照組：只加酶標記Ag。
④
夾心間接法

應用酶標記抗抗體測定Ag。Ab+Ag（待檢）+不同種動物的同的Ab+酶標抗第二種抗體的動物球蛋白（二抗）
2）
特定Ag基質球法（Defined antigen substrate sphere, DASS）

應用溴化氰活化的瓊脂糖球作為固相載體，將Ag或Ab結合于其上，制成免疫吸附劑。
2．均相酶免疫試驗（酶放大免疫試驗）

利用競爭原理，將含有小分子半Ag的樣品，酶標半Ag及相應Ab混合感作，隨后測定酶的活性。如果樣品中主要用于激素、抗菌素和嗎啡微生物等小分子半Ag的檢測，沒有半Ag，則酶標半Ag與Ab結合，酶的活性受到抑制。
ELISA的操作要領：
1．
固相載體的選擇
file:///C:/DOCUME~1/ADMINI~1/LOCALS~1/Temp/msohtml1/01/clip_image019.gif聚苯乙烯微量反應板

PVC塑料軟板

硝酸纖維素膜，斑點——ELISA（Dot—ELISA）

疏水聚酯布，布——ELISA（C-ELISA）
2．
預備試驗

確定酶結合物、包被抗原或抗體的最適濃度，底物的最適反應時間。
1）
酶結合物的確定

用PH9.6的碳的酸鹽緩沖液將IgG稀釋至100ug/ml,加入固相載體的每一孔中進行包被,洗滌后將酶結合物以1:200,1:400,1:800……作系列稀釋,依次加入各孔,每一稀釋度加2孔。反應完畢后加底物顯色，以能產生光吸收值（A）為1.0的稀釋度為結合物的最適濃度。
2）
包被蛋白質濃度的確定

將欲包被的蛋白質用PH9.6的碳酸鹽緩沖液作1：10，1：20，1：40…….系列稀釋，每一稀釋度包被2個孔，然后進行常規(guī)的ELISA操作。以能產生光吸收值（A）為1.0的稀釋度為包被蛋白質的最適濃度。
3）
底物最適作用時間的測定

以最適稀釋度Ag和酶結合物進行試驗，加入底物后在不同時向終止反應，即可確定最適反應時間。
3．
包被
1）
載體
2）
包被液的PH：通常用PH9.5~9.6,0.05mol.L or 0.1mol/L的碳酸鹽緩沖液稀釋Ag or Ab。吸咐時的PH一般為9.0左右。如PH較低，則吸附時間延長，但PH低于6.0則非特異性吸附增加。
3）
吸附時間與溫度，一般為4℃過夜，有時也可采用37℃吸附1-5h。
4）
蛋白質濃度，在固相載體上，每孔加入量一般為0.1-100us/ml。濃度太高，令固Ag或Ab蛋白分子之間的相互作用較大而影響載體對蛋白質的吸附，濃度太低，則感染性下降。
4．
洗滌，將載體各也甩干，再加洗滌充滿各孔，靜置3-7min如此重復3次。

常用的洗滌液：含有0.05%吐溫-20，0.01mol/L
PH7.4的PBS或含有0.05%吐溫-20，0.01mol/L
PH7.4的Tris-cl。
5．
封閉
抗原或抗體包被后，載體表面仍可能遺留有未吸附蛋白質的空白位點，從而造成下一步的非特異性吸附。
封閉液： 1%-3%牛血清白蛋白，3%-5%脫脂乳，10%?；蝰R血清加入封閉液后，37℃吸附 2h，然后洗滌。
6．
結果判定
1）
目視比色法：定性
2）
光電比色法：P/N比法，P/N值≥2.0為陽性

（七）聚合酶鏈反應（PCR）與疾病診斷

聚合酶鏈反應（ polymerase chain reaction, PCR）是1985年Mallis等根據(jù)核酸自然擴增的原理，建立的一種人工體外擴增DNA技術，目前已廣泛應用于病毒學研究及病毒病的診斷。
基本原理
PCR又稱為體外酶促基因擴增，即在模板DNA、引物和4種脫氧核糖核苷酸（dNTP）存在的條件下依賴于DNA聚合酶的體外擴增反應，其原理類似于天然DNA的復制。雙鏈靶DNA分子變性后解鏈，兩條單鏈DNA分別經復性與兩條引物互補結合，在4種dNTP存在和合適的條件下，由DNA聚合酶催化引物由5’――3’ 擴增延長，每經過變性、復性、延伸一個循環(huán)，模板DNA增加1倍，新合成的DNA鏈又可作為下一循環(huán)的模板，經過30-50個循環(huán)，可使原DNA量增加106-109倍。由于引物的序列決定了擴增的范圍，而數(shù)十個循環(huán)，又使原DNA模板大量增加，因此，PCR具有特異、敏感等許多優(yōu)點，適用于病毒性疾病的診斷。
主要步驟
PCR的每一個循環(huán)包括變性、復性、延伸3個步驟。
1）變性   通過加熱（90-95℃），使雙鏈DNA模板的氫鍵斷裂，雙鏈解離成單鏈。
2）復性   適當降溫（42-62℃），使引物與其互補的模板在局部形成雜交DNA雙鏈。
3）延伸
72℃，在DNA聚合酶、4種脫氧核糖核苷酸底物及Mg+離子存在的條件下，引物延長，新鏈合成。
幾種模板的處理方法
1.
細菌
    挑細菌于離心管中，加適量ddH2O，渦懸，于沸水浴中變性10min，迅速置冰浴中，然后3000rpm離心數(shù)秒，取上清作為模板。
2.
細胞培養(yǎng)物
收集病變的細胞（不要凍融）懸液，10000rpm離心數(shù)秒，取細胞沉淀用適量Sample Buffer懸浮，加入蛋白酶K至終濃度為100μg/ml，于37℃溫箱中作用1h，取出于沸水浴中變性10min,立即置冰浴中，3000rpm離心數(shù)秒,取上清作為模板。
Sample
Buffer

終濃度
KCl
50mM
Tris-HCl(pH9.0)
10mM
MgCl2
1.5mM
明膠
0.01%
Triton X-100
0.1%
NP-40
0.45%
Tween 20
0.45%
3. 質粒、病毒基因組DNA
沸水浴中變性10min，迅速置冰浴上備用。
4.
病料與鼻拭子
1)
用勻漿器將病料組織充分勻漿，用TEN緩沖液按1:5進行稀釋。
2)
收集懸液于離心管內，-20℃反復凍融三次。
3)
取出，5000rpm離心5min。
4)
取472.5μl上清液于另一離心管中，加入25μl 10%的SDS(終濃度為0.5%)

和2.5μl
20mg/ml的蛋白酶K(終濃度為100μg/ml)，混勻。
5)
50℃水浴過夜
6)
用等體積(500μl)的苯酚:異戊醇、苯酚:氯仿:異戊醇、氯仿:異戊醇各抽提一次
7)
吸取上清，加2倍體積的無水乙醇、0.1倍體積的3M NaAc于－20℃沉淀30min，

10000rpm離心10min。
8)
沉淀用70%乙醇洗一次，真空抽干，用20μl ddH2O溶解，－20℃保存?zhèn)溆谩?/font>

524343253

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