豬圓環(huán)病毒病血清學調查

寧衡

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　豬圓環(huán)病毒病血清學調查
            　　　　　　　　　　　 　　　　　　琚春梅 陳煥春 劉正飛 曹勝波 何啟蓋 敖艷華
         　　　　　　　　　　　　　　　　?。ㄈA中農業(yè)大學畜牧獸醫(yī)學院動物病毒室 武漢 430070）
摘要：本研究用豬2型圓環(huán)病毒ORF2基因的表達產物包被酶標板，建立ELISA診斷方法，用此方法對臨床1257份送檢血清進行了檢測，其總陽性率為57.28%（720/1257），仔豬陽性率為30.83%（119/386），肥豬陽性率為64.93%（137/211），母豬陽性率為71.50%（419/586），公豬陽性率為70.27%（52/74）。這一結果表明豬圓環(huán)病毒在我國流行較普遍，且抗體陽性率隨豬體年齡的增長而升高。
關鍵詞：豬2型圓環(huán)病毒；ORF2；ELISA；血清陽性率
豬圓環(huán)病毒（Porcine Circovirus,PCV）屬圓環(huán)病毒科，其基因組為一環(huán)狀單鏈DNA，病毒粒子無囊膜，呈二十面體對稱，直徑約為17nm[1，2]。PCV在細胞核內復制，并產生大量的核內包涵體[3]。目前認為PCV有兩種血清型：PCV1和PCV2，其中PCV1是PK-15細胞（ATCC CCL31）的一種污染物，它不引起可見的細胞病變（Cytopathogenic effect,CPE），感染豬也不出現(xiàn)臨床癥狀，而PCV2與進年來新出現(xiàn)的斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome,PMWS）密切相關[4]。PCV1與PCV2核苷酸同源性<80%，但其基因組結構相似，都含有兩個最大的開放閱讀框：ORF1和ORF2，其中ORF1變異很小，同源性為85%，主要編碼與病毒復制有關的Rep蛋白[5]，ORF2變異較大，編碼病毒的結構蛋白，此蛋白是病毒衣殼蛋白的主要成分。PCV1和PCV2 ORF2同源性約為65%，這表明PCV的型特異性抗原表位可能在相應的ORF2蛋白中。根據(jù)這一推測，Mahe[6]等通過對合成肽掃描分析已經繪出ORF2序列中的幾個PCV型特異性抗原表位。最近，Nawagitgul應用桿狀病毒表達系統(tǒng)表達出了完整的ORF2蛋白，并觀察到此蛋白可自我裝配成病毒樣粒子[7]。
郎洪武等用國外特異性表達抗原對我國PCV2進行的血清學調查表明，PCV2抗體陽性率很高[8]。此外，華中農業(yè)大學曹勝波等用所建立的PCR方法檢測43份PCV2可疑病料，結果有12份為陽性，陽性率為27.9%，其中有5份還同時檢測到了PPV或PRV[9]，據(jù)此可推測PCV2在我國可能較普遍。
目前，PCV2的診斷方法主要為PCR、免疫組化（ISH）、原位雜交、免疫過氧化物酶單層試驗（IPMA）以及間接免疫熒光（IFA），但這些方法主要用于檢測病原，且對實驗條件和技術要求較高。由于該病是近年來新發(fā)現(xiàn)的豬的傳染病，國內在這方面的研究工作才剛剛開始，為了弄清該病在我國的發(fā)病和流行情況，急需一種簡便、快速、敏感、特異且便于大規(guī)模應用的血清學診斷與檢測方法。基于此，本研究以本室分離鑒定的豬2型圓環(huán)病毒豫A株為材料，應用其ORF2基因表達產物為抗原包被酶標板，建立了ELISA診斷方法，并在臨床上進行了初步應用。
1.材料和方法
1.1ELISA最佳包被濃度的選擇
　　用ORF2表達產物從1:10開始倍比稀釋縱向包被酶標板奇數(shù)列6列,同樣用空白載體表達產物從1:10開始倍比稀釋縱向包被酶標板偶數(shù)列6列,陽性血清和陰性血清以相同比例橫向倍比稀釋8行做方陣滴定,以確定抗原最佳包被濃度。ELISA步驟同1.2，用酶標儀測各孔的OD630值，分別以奇數(shù)孔OD630值－偶數(shù)孔OD630值作為血清及抗原每一對應稀釋度的OD630值，計算各個稀釋度的P/N（P、N分別代表陽性、陰性血清的OD630值）值，以P/N值最大時的抗原濃度作為抗原最佳包被濃度。
1.2 ELISA診斷方法的建立
　　按1.1所選擇的最佳包被濃度包被酶標板，奇數(shù)列包被ORF2表達產物,偶數(shù)列包被空白載體表達產物。
具體步驟為：
1.2.1取預包被的酶標板，用洗滌液洗板3次，200μl/孔，每次靜置3分鐘倒掉，最后一次拍干。除空白對照孔外，每孔加入以樣品稀釋液1：40稀釋的待檢樣品，每孔加100μl，每份血清作2孔，一孔為ORF2表達產物包被孔，另一孔為空白載體包被孔。同樣1：40稀釋對照血清，設陽性對照2孔，陰性對照2孔，空白孔不加血清，輕輕振勻孔中樣品（勿溢出），置37℃溫育30分鐘。
1.2.2甩掉板孔中的溶液，用洗滌液洗板3次，200μl/孔，每次靜置3分鐘倒掉，最后一次拍干。
1.2.3每孔加酶標二抗100μl，置37℃溫育30分鐘。
1.2.4洗滌4次, 方法同1.2.2。
1.2.5每孔加底物A液、B液各1滴(50μl)，室溫避光顯色15分鐘。
1.2.6每孔加終止液1滴(50μl)，15分鐘內測定結果。
1.2.7結果判定
以空白孔調零，在酶標儀上測各孔OD630值，計算待檢血清的S/P值。若S/P≥0.45，則判為陽性，反之，則判為陰性。（陽性孔OD630應大于0.4）
1.3 臨床血清的檢測
　　用此ELISA方法對湖北、江西、上海、湖南、河南等省的1257份送檢血清進行了檢測，此次送檢血清為不同年齡階段豬的血清，包括仔豬，肥豬，公豬和母豬。
2.結果：
2.1 ELISA最佳包被濃度的確立
　　方陣滴定結果表明ORF2表達產物和空白載體表達產物濃度為20μg/ml時,P/N值最大，因此,以此濃度為抗原最佳包被濃度。
2.2 臨床送檢血清的ELISA檢測結果：
　　本研究對1257份送檢血清進行了檢測，其總陽性率為57.28%（720/1257），仔豬陽性率為30.83%（119/386），肥豬陽性率為64.93%（137/211），母豬陽性率為71.50%（419/586），公豬陽性率為70.27%（52/74）（見表1）。

檢測豬分類	檢測數(shù)（頭）	陽性數(shù)（頭）	陽性率（%）
仔豬	386	119	30.83
肥豬	211	137	64.93
母豬	586	419	71.50
公豬	74	52	70.27
合計	1257	720	57.28

3 .討論
　　用我們建立的ELISA方法對1257份臨床血清的檢測結果表明，PCV2的抗體陽性率隨豬體的年齡增長而升高，此結果與郎洪武[8]（2000）的報道相同。此外，我們檢測的74份公豬血清中有52份為陽性，陽性率高達70.27%，586份母豬血清中有419份為陽性,陽性率為71.50%,這表明該病在成年種豬中感染率較高,但種豬是否帶毒、持續(xù)感染以及垂直感染等深層次問題還有待進一步研究。
　　在本試驗中，我們也對ELISA陽性判定標準進行了探討。此陽性標準的計算方法參考了豬繁殖與呼吸綜合征檢測試劑盒（HerdChek IDEXX），并結合本研究略加改動。在對血清檢測結果進行判定時，我們以S/P=（pGEXORF2表達產物包被孔測得待檢血清OD值-空白載體pGEX-KG表達產物包被孔測得待檢血清OD值）/（pGEXORF2表達產物包被孔測得陽性血清OD值-空白載體pGEX-KG表達產物包被孔測得陽性血清OD值）>0.45作為陽性標準。

參考文獻：(略)

馮春偉

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