豬病實(shí)驗(yàn)室常規(guī)診斷技術(shù)（連載）之七、豬瘟檢測(cè)方法

nnii521 · 發(fā)表于 2009-6-23 22:02:17

七、豬瘟檢測(cè)方法

豬瘟間接血凝試驗(yàn)操作方法

（一）試驗(yàn)材料

1．96孔110~120°V型醫(yī)用血凝板

2．10~100微升可調(diào)微量移液器

3．塑料咀

4．豬瘟間接血凝抗原（豬瘟正向血凝診斷液），每瓶5毫升，可檢測(cè)血清25~30頭份

5．陽性對(duì)照血清，每瓶2毫升；陰性對(duì)照血清，每瓶2毫升

6．稀釋液每瓶10毫升

7．待檢血清每份0.2~0.5毫升（56℃水浴滅活30分鐘）

（二）操作步驟

1．檢測(cè)前，應(yīng)將凍干診斷液，每瓶加稀釋液5毫升浸泡7~10天后方可應(yīng)用。

2．稀釋待檢血清：在血凝板上的第1孔~第6孔各加稀釋液50微升。吸取待檢血清50微升加入第1孔，混勻后從中取出50微升加入第2孔，依此類推直至第6孔混勻后丟棄50微升，從第1孔——第6孔的血清稀釋度依次為1：2、1：4、1：8、1：16、1：32、1：64。

3．稀釋陰性和陽性對(duì)照血清：在血凝板上的第11排第1孔加稀釋液60微升，取陰性血清20微升混勻取出30微升丟棄。此孔即為陰性血清對(duì)照孔。

在血凝板上的第12排第1孔加稀釋液70微升，第2——7孔各加稀釋液50微升，取陽性血清10微升加入第1孔混勻，并從中取出50微升加入第2孔混勻后取出50微升加入第3孔……直到第7孔混勻后棄50微升，該孔的陽性血清稀釋度為1：512。

4．在血凝板上的第1排第8孔加稀釋液50微升，作為稀釋液對(duì)照孔。

5．判定方法和標(biāo)準(zhǔn)：先觀察陰性血清對(duì)照孔和稀釋液對(duì)照孔，紅血球應(yīng)全部沉入孔底，無凝集現(xiàn)象（—）或呈（+）的輕度凝集為合格；陽性血清對(duì)照應(yīng)呈（+++）凝集為合格。

在以上3孔對(duì)照合格的前提下，觀察待檢血清各孔的凝集程度，以呈“++”凝集的待檢血清最大稀釋度為其血凝效價(jià)（血凝價(jià)）。血清的血凝價(jià)達(dá)到1：16為免疫合格。

“-”表示紅細(xì)胞100%沉于孔底，完全不凝集

“+”表示約有25%的紅細(xì)胞發(fā)生凝集

“++”表示50%紅細(xì)胞出現(xiàn)凝集

“+++”表示75%紅細(xì)胞凝集

“++++“表示90—100%紅細(xì)胞凝集

6．注意事項(xiàng)

（1）
勿用90°或130°血凝板，以免誤判。

（2）
污染嚴(yán)重或溶血嚴(yán)重的血清樣品不宜檢測(cè)。

（3）
凍干血凝抗原，必須加稀釋液浸泡7~10天，方可使用，否則易發(fā)生自凝現(xiàn)象。

（4）
用過的血凝板，應(yīng)及時(shí)沖冼干凈，勿用毛刷或其他硬物刷洗板孔，以免影響孔內(nèi)光潔度。

（5）
使用血凝抗原時(shí)，必須充分搖勻，瓶底應(yīng)無血球沉積。

（6）
液體血凝抗原4~8℃貯存有效期四個(gè)月，可直接使用。凍干血凝抗原4~8℃貯存有效期三年。

（7）
如來不及判定結(jié)果或靜置2小時(shí)結(jié)果不清晰，也可放置第2天判定。

（8）
每次檢測(cè)，只設(shè)陰性、陽性血清和稀釋液對(duì)照各1孔。

（9）
稀釋不同的試劑要素時(shí)，必須更換塑料咀。

（10）血凝板和塑料咀洗凈后，自然干燥，可重復(fù)使用。

(李樹春)

豬瘟病毒強(qiáng)弱毒鑒別診斷ELISA操作方法

（一）試驗(yàn)材料

1．豬瘟弱毒單抗純化酶聯(lián)抗原和豬瘟強(qiáng)毒單抗純化酶聯(lián)抗原，分別供檢測(cè)經(jīng)豬瘟弱毒疫苗免疫后產(chǎn)生的抗體和感染豬瘟強(qiáng)毒后產(chǎn)生的抗體之用。

2．酶標(biāo)抗體

3．豬瘟陽性、陰性血清

4．酶聯(lián)板及其他必要的試劑。

（二）操作步驟

1．用包被液將豬瘟弱毒單抗純化酶聯(lián)抗原、豬瘟強(qiáng)毒單抗純化酶聯(lián)抗原各作100倍稀釋，以100微升分別加入做好標(biāo)記的酶聯(lián)板孔中，置濕盒于4℃過夜。

2．棄去孔內(nèi)液體。用洗滌液沖洗酶聯(lián)板3次，每次間隔3~5分鐘，拍干。
3．用稀釋液將待檢血清作400倍稀釋，每孔加100微升。同時(shí)，將豬瘟陽性、陰性血清以100稀釋作對(duì)照，37℃培育1.5~2小時(shí)。
4．重復(fù)第2步。
5．用稀釋液將兔抗豬IgG—辣根過氧化物酶結(jié)合物作100倍稀釋，每孔加入100微升，37℃培育1.5~2小時(shí)。
6．重復(fù)第2步。

7．每孔加入底物溶液（每塊板所需的底物溶液按鄰苯二胺5毫克+底物緩沖液5毫升+30%過氧化氫18.75微升配制）100微升，室溫下觀察顯色反應(yīng)（一般陰性對(duì)照孔略微顯色，立即終止反應(yīng)，并以陰性孔作空白調(diào)零）。
8．每孔加入終止液50微升，于酶聯(lián)讀數(shù)儀上測(cè)定490nm波長的光密度（OD）。
（三）判定標(biāo)準(zhǔn)
在豬瘟弱毒酶聯(lián)板上：OD>0.2為豬瘟弱毒抗體陽性

OD<0.2為豬瘟弱毒抗體陰性
在豬瘟強(qiáng)毒酶聯(lián)板上：OD≥0.5為豬瘟強(qiáng)毒抗體陽性

OD<0.5為豬瘟強(qiáng)毒抗體陰性
（四）注意事項(xiàng)

1．運(yùn)輸單抗純化酶聯(lián)抗原時(shí)，必須使用冰盒低溫運(yùn)輸；豬瘟強(qiáng)弱毒單抗純化酶聯(lián)抗原在4℃保存6個(gè)月，在—18℃保存12個(gè)月。

2．配制洗滌液時(shí)，應(yīng)使用新鮮蒸餾水或無離子水，每次洗板后，盡量不使孔中有殘余液體，以免影響結(jié)果。

3．底物溶液應(yīng)臨用前配制，待鄰苯二胺完全溶解于底物緩沖液后再加過氧化氫，混勻后立即加入孔中。
1．
終止反應(yīng)后，應(yīng)立即讀數(shù)。

(中國獸藥監(jiān)察所)

豬瘟反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)

1．材料準(zhǔn)備：待檢組織，勻漿器、氯仿、異丙醇、75%乙醇、生理鹽水，RNA提取試劑盒（Omega），RT-PCR試劑盒（TakaRa）等。
引物：擴(kuò)增豬瘟病毒E2基因中585bp基因片段，由上海生物工程公司合成。
序列為：上游引物P1：5’—CCTGCAAGGAAGATCACACG—3’
下游引物P2：5’—CCGTGTAGGTCACTGGTTCA—3’
儀器設(shè)備為：PCR擴(kuò)增儀，電泳儀，凝膠電泳紫外檢測(cè)儀。
2．操作步驟
2．1 樣品采集：動(dòng)物病死或撲殺后，取扁桃體、淋巴結(jié)和脾組織，-20℃冷藏。
2．2 樣品處理：所采病料經(jīng)組織研磨器充分研磨，按1:5生理鹽水收集于離心管內(nèi)，-70℃反復(fù)凍融三次，7000r/min，離心5分鐘，取上清液。
2．3 RNA提?。阂勒?/font>Omega公司RNA提取試劑盒的操作程序提取總RNA。
2．4 RT-PCR操作程序：依照TakaRa公司的一步法RNA PCR試劑盒操作程序進(jìn)行。
擴(kuò)增條件為：50℃，反轉(zhuǎn)錄30分鐘，94℃變性5分鐘，進(jìn)入循環(huán)，94℃ 50秒，72℃ 60秒，40個(gè)循環(huán)后72℃延伸10分鐘。
3．RT-PCR產(chǎn)物檢測(cè)：擴(kuò)增產(chǎn)物在0.8%瓊脂糖凝膠上電泳，EB染色，在紫外光下與標(biāo)準(zhǔn)分子量比較，如見585bp片段，初步診斷為陽性。