豬病實(shí)驗(yàn)室常規(guī)診斷技術(shù)之十三、豬喘氣病間接血凝試驗(yàn)操作方法

nnii521 · 發(fā)表于 2009-6-24 21:20:15

十三、豬喘氣病間接血凝試驗(yàn)操作方法

本方法系用肺炎霉形體（M.hyopneumeniae）抗原致敏戊二醛處理的綿羊紅細(xì)胞，凍干后作為抗原，供作間接血凝反應(yīng)檢測(cè)豬霉形體肺炎（豬喘氣?。┛贵w之用。

（一）準(zhǔn)備

1．凍干的10%抗原致敏紅細(xì)胞，至6~8℃或低溫保存，使用時(shí)每支加1/15M，pH7.2磷酸鹽緩沖鹽水（PBS下同）5毫升，即為2%抗原致敏紅細(xì)胞，供作抗原之用。

2．凍干的陽性、陰性豬血清：在4~8℃或低溫保存，使用時(shí)每支各加PBS 1毫升（已為2.5倍稀釋），混勻后，供作陽性，陰性豬血清對(duì)照之用。

3．凍干的健康兔血清：在4~8℃或低溫保存，使用時(shí)，每支（1毫升）啟封后加到50毫升 PBS中即為1%健康兔血清稀釋劑，供作稀釋被檢血清，陰性、陰性對(duì)照豬血清及預(yù)濕稀釋棒之用。

4．10%戊二醛化紅細(xì)胞：在4~8℃或低溫保存，使用時(shí)，搖勻后取需要量經(jīng)低離心去掉上液，將紅細(xì)胞用PBS稀釋液成2%的懸浮液，作吸收初檢豬血清中的嗜異性因子之用。

5．被檢豬血清的處理：分離出來的豬血清先經(jīng)56℃30分鐘滅活，然后每頭豬血甭取0.2毫升，加0.3毫升2%戊二醛紅細(xì)胞37℃吸收30分鐘，經(jīng)低速離心或自然沉淀后，用稀釋棒小心地蘸取上面的血清（已為2.5倍稀釋）作檢驗(yàn)抗體之用。

6．微量反應(yīng)板：為72孔“V”型有機(jī)玻璃制品（市售品），供作微量間接血凝反應(yīng)之用。

7．微量稀釋棒：備有每支載量為0.025毫升的微量稀釋棒1~2套（每套12支），供作稀釋血清之用（市售品）。

8．微量移液器：供滴加稀釋劑和抗原致敏紅細(xì)胞之用（市售品）。

（二）操作方法

1．首先用記號(hào)筆在微量反應(yīng)板的一邊標(biāo)明被檢血清，陽性、陰性對(duì)照豬血清及抗原對(duì)照，各占一橫排孔。

2．滴加稀釋劑：用微量移液器每孔加0.025毫升稀釋劑。

3．血清稀釋：使用微量稀釋棒先在稀釋劑中預(yù)濕后，以濾紙吸干，再小心地蘸取被檢豬血清，立于第一孔中，可以同時(shí)稀釋11個(gè)血清，以又手合掌迅速搓動(dòng)11根稀釋棒，達(dá)60次，然后11根稀釋棒小心移至第2孔，搓動(dòng)同樣轉(zhuǎn)速和次數(shù)，再移至第3孔（被檢豬血清可以只測(cè)到第3孔，即血清稀釋到1：20），而陽性、陰性對(duì)照豬血必須稀釋到第6孔。

4．滴加抗原致敏紅細(xì)胞：用微量移液器吸取搖勻后的2%抗原致敏紅細(xì)胞，每孔加0.025毫升。

5．抗原對(duì)照：為0.025毫升稀釋液+0.025毫升2%抗原致敏紅細(xì)胞,只用2孔。

6．振蕩：以上加樣完畢后，置微型振蕩15~30秒，靜置室溫1~2小時(shí)觀察記錄結(jié)果。

（三）結(jié)果判定

以呈現(xiàn)（++）血凝反應(yīng)的最高稀釋度作為血清效價(jià)終點(diǎn)。血凝反應(yīng)強(qiáng)度表示如下。

++++：紅細(xì)胞在孔底凝成團(tuán)塊，面積較大。

+++：紅細(xì)胞在孔底形成較厚層凝集，卷邊呈鋸齒狀。

++：紅細(xì)胞在孔底形成薄層均勻凝集面積較上二者大，“++”以上的凝集為紅細(xì)胞凝集陽性。

+：紅細(xì)胞不完全沉于孔底，周圍少量凝集。

±：紅細(xì)胞沉于孔底，但周圍不光滑或中心空白。

-：紅細(xì)胞呈點(diǎn)狀濾于孔底，周邊光滑。

微量反應(yīng)板靜置1~2小時(shí)后，正常結(jié)果是陽性對(duì)照豬血清效價(jià)≥1：10，陰性對(duì)照豬血清效價(jià)<1：5，抗原對(duì)照無自凝現(xiàn)象。