豬病實驗室常規(guī)診斷技術(shù)之十六、乙型腦炎檢測方法

nnii521 · 發(fā)表于 2009-6-24 21:23:15

十六、乙型腦炎檢測方法

豬乙型腦炎乳膠凝集試驗（LAT）診斷試劑盒使用說明書
豬乙型腦炎是由流行性日本乙型腦炎病毒（JEV）引起的豬的一種繁殖障礙性疾病。此病引起妊娠母豬流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎，公豬睪丸腫脹，萎縮、喪失配種能力及新生仔豬痙攣死亡。臨床上該病多呈散發(fā)，流行常發(fā)生于蚊蟲滋生的炎熱季節(jié)，，患畜病初體溫升高、精神沉郁、跛行、有神經(jīng)癥狀，病愈后隱性帶毒，種豬表現(xiàn)繁殖障礙，該病給養(yǎng)豬業(yè)帶來較大的經(jīng)濟損失。
豬乙型腦炎乳膠凝集試驗是用乙腦弱毒疫苗毒株經(jīng)純化、濃縮等程序后致敏乳膠，制成乳膠凝集試驗用抗原，用于檢測動物血清中的乙腦病毒抗體，可在現(xiàn)場進行，具有安全、簡便、快速、特異、敏感之優(yōu)點。
1．試劑盒的內(nèi)容：
本品包括豬乙型腦炎致敏乳膠抗原、陽性血清、陰性血清、稀釋液、玻片、吸頭及使用說明書。
2．制品用途：
用于豬乙腦血清學(xué)診斷。
3．使用方法：
3．1
定性試驗：
取待檢樣品（血清）、陽性血清、陰性血清、稀釋液各一滴（約15微升左右），分別置于玻片上，再各加乳膠抗原一滴，用牙簽混勻，攪拌并搖動1~2分鐘，于
3~5分鐘內(nèi)觀察結(jié)果。
3．2
定量試驗：
先將血清作連續(xù)稀釋，各取1滴依次滴加于乳膠凝集反應(yīng)板上，另設(shè)對照同上，隨后再各加乳膠抗原一滴，如上攪拌并搖動，判定。
4．
結(jié)果判定：
4．1對照試驗：
出現(xiàn)如下結(jié)果試驗方可成立，否則應(yīng)重試：陽性血清加抗原呈“++++”；陰性血清加抗原呈“—”；抗原加稀釋液呈“—”。
4．2
判定標(biāo)準(zhǔn)：
   “++++”全部乳膠凝聚，顆粒聚于液滴邊緣，液體完全透明；
   “+++” 大部分乳膠凝集，顆粒明顯，液體稍混濁；
   “++”  約50%乳膠凝集，但顆粒較細，液體較混濁；
   “+” 有少許凝集，液體呈混濁；
   “—”  液滴呈原有的均勻乳狀。
   以出現(xiàn)“++”以上凝集為陽性。
5.
貯藏:
在2-8℃冷暗處保存，有效期暫定1年。
6.附注：被檢樣品采集及處理方法。
6．1 血清：按常規(guī)方法分離血清，要求無腐敗。

6．2 使用前應(yīng)輕輕搖勻乳膠抗原。

(吳
斌)

豬乙型腦炎血凝抑制試驗操作方法
（一）
實驗血清處理
1．非特異性抑制素除凈法：取0.1毫升血清（未稀釋）加0.9毫升 12.5%高嶺土（或白陶土）溶液，混合后放室溫中20分鐘，然后以約2500轉(zhuǎn)/分鐘離心15~20秒，上清液即為1:10的血清。
2．非特異性凝集的除凈法：經(jīng)高嶺土（或白陶土）處理好的血清，加入30%（6.4鹽水配）鴿或鵝血球0.1毫升；中間振蕩混合2~3次，在37℃或4℃過夜，然后1500轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，上清液即可作HI試驗血清。
（二）配制4個單位血凝素，按血凝素滴定結(jié)果配制，血凝素單位滴度測定：
1．
取已處理之清潔干燥微量料板。
2．
手持吸入pH9.0鹽水之微量吸管直立滴入各孔中，每孔1滴為0.025毫升。
3．
用稀釋棒蘸取0.025毫升血凝素于第一孔中，（也可用微量吸管取0.025毫升血凝素加入第一孔中），再用稀釋棒作倍比稀釋，棒在每孔中要直立旋轉(zhuǎn)30~50次，使血凝素充分混勻，出孔時勿碰孔壁。

孔號成分	1	2	3	4	5	6	血球對照
9.0鹽水(ml) 血清(1:10ml)	0.025 0.025	0.025 0.025	0.025 0.025	0.025 0.025	0.025 0.025	0.025 棄 0.025 0.025	0.5
血凝集 (4單位ml)	0.025	0.025	0.025	0.025	0.025	0.025
0.5%鴿血球	0.05	0.05	0.05	0.05	0.05	0.05	0.05

混勻加蓋1小時

（三）血凝抑制操作方法按下表進行。

孔號成分	1	2	3	4	5	6	7		血清對照		血球對照
9.0鹽水(ml) 血清(1:10ml)	0.025 0.025	0.025 0.025	0.025 0.025	0.025 0.025	0.025 0.025	0.025 0.025	0.025 0.025		0.025 0.025		0.025 棄 0.025
血凝集 (4單位ml)	0.025	0.025	0.025	0.025	0.025	0.025	0.025		0.025		0.025
混勻、加蓋置4℃過夜或室溫2小時
0.5%鴿血球	0.05	0.05	0.05	0.05	0.05	0.05	0.05	0.05		0.05

混勻，放室溫1—2小時觀察結(jié)果。

(吳斌)

乙型腦炎反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）
1．材料準(zhǔn)備：待檢材料、組織勻漿器、TEN緩沖液、氯仿、無水乙醇、異丙醇、75%乙醇、TRI20L裂解液、RT-PCR試劑盒。
引物：擴增乙型腦炎病毒中447-P77之間50/bp基因片段，由上海生物工程公司合成，其序列為：
上游引物5’—TCA TGT GGC TCG CGA GC—3’
下游引物5’—TCT GTA AGC CGG AGC G—3’
儀器設(shè)備：凝膠電泳紫外檢測儀、PCR擴增儀、電泳儀
2．操作步驟
2．1 樣品采集對于病死或撲殺動物，取腦組織，腦脊髓液血清等，對于待檢活豬，無菌采集血液，收集血清，冷藏送檢。
2．2 病毒RNA抽提所采病料經(jīng)組織研磨器充研磨，按1：5用TEN緩沖液懸浮收集于離心管中，反復(fù)凍融3次后經(jīng)7000rpm離心5分鐘，取上清液。取上清液（或血清）250μl并加入750μl TRIIOL裂解液于室溫作用10-15分鐘，加入氯仿200μl，劇烈振蕩，室溫下放置10-15分鐘，再于12000rpm離心15分鐘。待分層以后，吸蟲上層水相約500μl，加入等體積的異丙醇，混合后置室溫下沉淀RNA用適量的滅菌DEPC水溶解，立即進行RT-PCR。
2．3 RT-PCR操作程序按RT-PCR試劑盒操作說明書進行。反應(yīng)體系（50μl）組成如下：
10×緩沖液
5μl

25mM MgCh
10μl
10mM dNTPs
5μl
RNA酶抑制劑
1μl
AmV Rtase XL
1μl
AmV-optimized Taq
1μl
引物
2μl
Template
10μl
滅菌DEPC水
13μl
反轉(zhuǎn)錄條件為50℃ 30分鐘
擴增條件，94℃變性2分鐘，進入循環(huán)，94℃ 3秒，58℃ 40秒，72℃ 2分30秒，35個循環(huán)后72℃延伸10分鐘。
2．4 RT-PCR產(chǎn)物的檢測。擴增產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠、電泳、溴化乙錠染色、在紫外光下觀察與標(biāo)準(zhǔn)分子量比較，即可獲得結(jié)果。