探討《芽孢桿菌活菌檢測方法》

孟俊英

一培養(yǎng)基

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)法

二用具及試劑

超凈工作臺、滅菌平皿、酒精燈、滅菌試管15×150型及18×180型（放入幾粒玻璃珠并加棉塞）、5000/2000/200μL滅菌槍頭、無菌水、玻璃涂棒、培養(yǎng)箱。

三步驟

1 制備平板

將營養(yǎng)瓊脂滅菌后待冷至55~60℃時倒平板，右手持盛培養(yǎng)基的三角瓶置火焰旁邊，用左手將瓶塞輕輕拔出，瓶口保持對著火焰；然后左手拿培養(yǎng)皿并將皿蓋在火焰附近打開一縫，迅速倒入培養(yǎng)基約15亳升，加蓋后輕輕搖動培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基均勻分布在培養(yǎng)皿底部，然后平置在桌面上待凝，培養(yǎng)基凝固后將平板倒置于37℃培養(yǎng)箱中24h進行無菌檢測，無雜菌污染者備用。

2 有效菌數(shù)及雜菌率的測定

以無菌操作將經(jīng)過充分混勻的試樣5g，80℃滅菌10min，放入含有495mL無菌水帶玻璃珠的滅菌三角瓶內(nèi)，靜置20min后置于旋轉(zhuǎn)式搖床上，以200rpm的轉(zhuǎn)速搖min，即成1%的稀釋液。

用經(jīng)過滅菌的1000μL移液器（槍頭滅菌）吸取1%的稀釋液1mL，沿管壁徐徐注入含有9mL無菌水的試管內(nèi)（注意槍頭尖端不要觸及管內(nèi)稀釋液），混勻成1：1000稀釋的菌懸液，這樣依次稀釋，分別得到1：1×104、1：1×105、1：1×106、1：1×107、1：1×108等濃度（每個稀釋度必須更換無菌槍頭）。

用200μL移液器分別吸取稀釋度為1：1×106、1：1×107、1：1×108的稀釋液100μL，加至平皿內(nèi)的無菌培養(yǎng)基表面，用無菌涂布器將菌懸液均勻地涂布于培養(yǎng)基表面。每一稀釋度重復3次，同時加無菌水的空白對照，37℃培養(yǎng)20~40h，每個稀釋度取5~10個菌落的菌體，涂片染色，顯微鏡觀察識別后計數(shù)菌落。

3 菌落計數(shù)

以平板上出現(xiàn)30-300個菌落數(shù)的稀釋度為計數(shù)標準。

當只有一個稀釋度，其平均菌落數(shù)在30~300之間，則以該平均菌落數(shù)乘以其稀釋倍數(shù)；

若有兩個稀釋度，其平均菌落數(shù)均在30~300之間，應按兩面三刀者菌落總數(shù)之比值來確定；若其比值小于等于2應計數(shù)兩者的平均數(shù)，若大于是則計數(shù)其中稀釋度較小的菌落總數(shù)；

若三個稀釋度的平均菌落數(shù)均大于300，則應按稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)；

若三個稀釋度的平均菌落數(shù)均小于30，則應按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)；

若三個稀釋度的平均菌落數(shù)確均不在30~300之間，則以最近300或30的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)。

4 計算

每克樣品的菌數(shù)同一稀釋度幾次重復的平均菌落數(shù)×10×稀釋倍數(shù)

雜菌率=雜菌數(shù)/總菌數(shù)×100%

首先聲明這個方法除斜體字部分外均是引用某公司推薦檢驗方法。因為存疑所以發(fā)貼在此探討：

（1）斜體字部分是滅菌方法，應對芽孢桿菌的休眠體無損。如果模擬飼料加工條件則干熱滅菌與濕熱滅菌那個更適合？（注：畜禽飼料制粒時通入的是干飽和蒸汽；水產(chǎn)料則不盡然）

（2）這個培養(yǎng)方法對不同品種的芽孢桿菌的檢測結(jié)果是否有可比性？

孟俊英

回復 2# 登高遠眺

請談一談這種方法的有效性。是否仍有改進之處

lswst

菌落計數(shù)部分好像有些自相矛盾