甜菜堿藥物分析進展 關(guān)鍵詞】
甜菜堿
提取分離
定量
高效液相色譜法
甜菜堿(betaine,Bet)又名甘氨酸甜菜堿、甜菜素,化學(xué)名稱是三甲基氨基乙酸或三甲銨乙內(nèi)酯,19世紀最早發(fā)現(xiàn)于歐洲,是一種季銨型水溶性生物堿,廣泛存在于動植物和微生物體內(nèi)。其分子式為C5H11NO2,結(jié)構(gòu)式為(CH3)3N+CH2COO?,外觀物理形狀呈流動性,為鱗狀或棱狀白色結(jié)晶,易溶于水和甲醇,由于常溫時極易吸濕潮解,應(yīng)用時常將其制成甜菜堿鹽酸鹽(鹽酸甜菜堿)。自上世紀70年代以來,甜菜堿的研究漸成熱點,已被廣泛應(yīng)用于畜牧、醫(yī)藥、農(nóng)林、食品和日化等領(lǐng)域。特別是在醫(yī)藥領(lǐng)域,甜菜堿許多優(yōu)良的藥理作用被相繼發(fā)現(xiàn),可用于對抗高同型半胱氨酸綜合癥,能保肝護腎、保持心臟與血管健康、維護消化系統(tǒng)、抑瘤抗癌、降壓鎮(zhèn)靜、解熱鎮(zhèn)痛、耐缺氧、保護細胞抵抗高滲等等。體內(nèi)組織或排泄物中甜菜堿的測定有助于臨床上診斷人體內(nèi)代謝異常與否[1],許多甜菜堿藥效研究需要對其進行治療藥物監(jiān)測,這都涉及到甜菜堿的分析測定。如何更準確、簡單、快速、經(jīng)濟地從生物樣品中分離并定量甜菜堿,一直是學(xué)者們努力的方向。
1 從生物樣品中提取分離甜菜堿
基于甜菜堿的溶解性特點,從生物樣品中提取甜菜堿最常用的方法有水提和醇提兩種,如Hitz和Hanson[2]將生物樣品90℃水浴1h,冷卻后研磨,2 ℃去離子水浸提共3次,最后65 ℃減壓濃縮;最早提出提取甜菜堿方法的Pearce等[3]使用甲醇對生物樣品反復(fù)提取3次,然后于65 ℃減壓濃縮。國內(nèi)有用堿性三氯甲烷提取甜菜堿的報道[4],樸茨茅斯大學(xué)的楊昕等[5]則采用了混合提取法,將甲醇?氯仿?0.2 mol·L?1碳酸氫鉀(12:5:1 v/v)加入生物樣品,60 ℃分別提取2次,然后用甲醇?水(1:1 v/v)60 ℃加熱提取,取得較好效果。
基于甜菜堿的兩性季銨型生物堿的特殊結(jié)構(gòu),對其分離純化大多使用離子交換法。該方法是利用離子交換劑上的可交換離子與周圍介質(zhì)中被分離的各種離子間的親和力不同,經(jīng)過交換平衡達到分離目的的一種柱色譜法[6]。Horst[7]、劉新亞等[8]、尹昆等[9]分離提純甜菜堿均使用了此類方法,都是將提取液依次通過強堿性陰離子交換樹脂、強酸性陽離子交換樹脂,最后用氫氧化銨洗脫。此法能除去提取液中的氨基酸、蛋白質(zhì)、多糖和苷類等成分,最終使測量結(jié)果準確可靠。吳志榮[10]、楊東輝[11]則利用了薄層層析法來分離純化甜菜堿,但如何選擇優(yōu)良的展開劑、顯色劑仍是制約該法的一個瓶頸。另外谷大建等[12]采用Oasis HLB固相萃取小柱對樣品進行純化,得到較好的效果。
2 甜菜堿定量分析方法
對于甜菜堿的定量測定,自Pearce等發(fā)布碘量法[3]以來,又出現(xiàn)了可見一紫外分光光度法[13?14]、薄層掃描法[15]、非水滴定法[16]等許多分析方法,目前的主流方法是高效液相色譜(HPLC)法。
2.1 高效液相色譜(HPLC)法
該法準確、快速,再現(xiàn)性高,可連續(xù)進樣,能滿足體內(nèi)藥物分析大樣本快速分析要求。根據(jù)選用色譜柱、檢測器種類及是否對甜菜堿進行衍生化,目前HPLC法大致分為以下幾種方案。
2.1.1 反相C18柱?紫外檢測器?直接測定
陳少良等[17]在測定甜菜堿時采用的流動相為50 mmol·L?1KH2PO4(pH4.45)和0.1%PIC B_8(辛烷磺酸),流速0.7 ml·min?1,檢測波長為192 nm,測得甜菜堿的保留時間為6.3 min,加樣回收率達到90 %左右;尹昆等[9]、谷大建等[12]均采用類似的方法,測得甜菜堿保留時間分別為2.5 min、4.01 min,加樣回收率在90%以上。
2.1.2 LC?SCX、CLC?ODS柱?紫外檢測器?甜菜堿衍生化后測定
基于甜菜堿在近紫外區(qū)測定干擾大,保留時間短的特點,人們采用先將其衍生化再測定的方法。Laryea等采用[18]?冠醚?6及4?溴代苯甲酰甲基溴作為衍生試劑與樣品和KH2PO4混勻后80 ℃加熱60 min,制得甜菜堿的衍生物,使用強酸性陰離子交換色譜柱(LC?SCX),流動相為乙腈?水(90:10 v/v),10 mmol·L?1膽堿,流速1.5 ml·min?1,檢測波長為254nm來測定血樣和尿樣中的甜菜堿含量,發(fā)現(xiàn)衍生物保留時間為14.8 min,檢測最低限為5 μmol·L?1,效果良好。Lever等[19]、Mar MH等[20]亦采用這種方法對甜菜堿進行了成功檢測。許明旺等[21]則采用了18?冠醚?6及2,4?溴代苯甲酰甲基溴作為衍生試劑,使用CLC?ODS色譜柱,流動相為乙腈?水(35:65,其中含有0.1 mol/L的NaClO4),流速1 ml·min?1,檢測波長254 nm,測得衍生物保留時間為13 min,加樣回收率在95%以上。姚少威等[22]采用相同的方法檢測了復(fù)方枸杞顆粒中的甜菜堿含量,加樣回收率亦在95%以上。
2.1.3 胺基柱?紫外檢測器?直接測定
廖國玲等[23]采用Lichrospher NH2色譜柱,以乙腈?水(85:15 v/v)為流動相,流速0.7 ml·min?1,檢測波長195 nm,測定枸杞中甜菜堿,保留時間為16.58 min,平均回收率為98.9%,方法較為簡單,重現(xiàn)性好。
2.1.4 胺基柱?蒸發(fā)光檢測器?直接測定
基于甜菜堿在近紫外區(qū)測定干擾大的特點,龔立冬等[24]使用蒸發(fā)光檢測器代替紫外檢測器,采用Waters Spherisorb S5 NH2色譜柱,流動相為0.1%(體積分數(shù))三氟乙酸水溶液?甲醇(l5:85 v/v),流速為0.6 ml·min?1,蒸發(fā)光散射檢測器中漂移管溫度90 ℃,測定肉蓯蓉中的甜菜堿,加樣回收率達到99%以上。李向陽等[4]也采用胺基柱、蒸發(fā)光檢測器,流動相為乙腈?水(25:75 v/v),流速1.0 ml·min?1,漂移管溫度50 ℃,進行甜菜堿含量測定,加樣回收率在97%以上。
2.2 其他分析方法 2.2.1 可見一紫外分光光度法
這種方法應(yīng)用較早,主要利用樣品與顯色劑發(fā)生顯色反應(yīng)而生成有色物質(zhì),以便使用分光光度計進行測定。Barak等[13?14]處理后的肝組織樣品與冷卻的KH2混合產(chǎn)生碘化物沉淀,離心后用二氯乙烷溶解沉淀,在365 nm處測定吸光度,通過工作曲線計算出了甜菜堿含量。但該法干擾因素較多,特別是在測定低含量樣品時誤差較大。
2.2.2 薄層掃描法
郭輝等[15]用0.5%羧甲基纖維素鈉的硅膠G薄層板,以氯仿?甲醇?甲酸?水(2:8:2.2:0.5)為展開劑,以改良碘化泌鉀溶液為顯色劑,掃描波長為498 nm,對肝腎滋中的甜菜堿含量進行了測定。其最低檢出限為22.8 μg,加樣回收率在95 %以上。由于操作中難以保持展開溫度、展開劑極性及蒸氣壓等諸多條件的恒定,該法重現(xiàn)性并不是很理想。
2.2.3 非水滴定法
這是一種經(jīng)濟簡便的測定方法,齊永秀等[16]以冰醋酸作為溶媒,以結(jié)晶紫作為指示劑,使用0.1 mol·L?1標準高氯酸溶液滴定并考察了不同廠家生產(chǎn)的鹽酸甜菜堿的純度,平均回收率為99.81%,相對標準偏差(RSD)為0.19%。該法穩(wěn)定性及重現(xiàn)性較好,但無法滿足大樣本連續(xù)分析的要求。
2.2.4 微型電極法
國外學(xué)者[25]曾用此法測定了甲基胺混合物中甜菜堿的含量。該法以甘汞電極為參比電極,玻璃微型電極為測定電極,用雙靜電計記錄電壓的方法測定甜菜堿含量,具有響應(yīng)快、靈敏度高的特點,但前處理過程麻煩,也無法滿足大樣本連續(xù)分析的要求。
2.2.5 質(zhì)譜法與核磁共振法
質(zhì)譜法通常與氣相色譜儀或液相色譜儀聯(lián)用來達到理想分離與精密測定的效果。Holm等[26]使用這種方法對血漿中的甜菜堿、膽堿、二甲基甘氨酸進行了測定。國外學(xué)者還利用1H NMR法測定了病人尿樣中的甜菜堿[27]。不可否認這兩種方法具有較高的精確性與靈敏度,但儀器較為昂貴,難以在大范圍內(nèi)推廣。
3 小
結(jié)
對甜菜堿的提取分離應(yīng)結(jié)合具體生物樣品及檢測手段,隨著檢測手段的改進,提取分離也將趨向簡單化、自動化。提取一般使用水、甲醇,而分離純化一般使用離子交換樹脂法,更為簡單的SPE(固相萃取)法也將得到廣泛應(yīng)用。對甜菜堿進行測定一般使用HPLC法?;谔鸩藟A的強極性特點,分析柱的選擇越來越傾向于使用胺基柱,它能克服甜菜堿保留時間短,干擾大的缺點;對于僅配有紫外檢測器的實驗室來講,從檢測效果看衍生化法具有一定優(yōu)勢,國外尤為盛行,但操作復(fù)雜;如若克服使用近紫外檢測干擾大的缺點,蒸發(fā)光檢測器不失為一種良好選擇。一般實驗室如處理樣品樣本量少、對自動化要求不高,則非水滴定法、微型電極法可滿足條件,且靈敏度較為理想。 |