通過育種技術有可能降低PCVAD的發(fā)病率

朱春明

　　通過對65日齡體重、豬圓環(huán)病毒（PCV2）病毒血癥以及抗體滴度等性狀進行選育，可能降低豬圓環(huán)病毒相關疾?。≒CVAD）的發(fā)病率，這是Jared S. Bates及其同事得出的結論。他們的試驗已在2009年《內(nèi)布拉斯加養(yǎng)豬報告》上發(fā)表。


摘要

科研人員對內(nèi)布拉斯加窩產(chǎn)仔數(shù)選育品系當中的3,440頭豬進行了試驗，研究了遺傳和環(huán)境對豬圓環(huán)病毒相關疾病（PCVAD）的發(fā)病率和豬對圓環(huán)2型病毒（PCV2）的免疫反應的影響，以及這些因素與體重之間的關系。

　　分別于出生、斷奶、65日齡和180日齡對試驗豬進行稱重，并于70至180日齡之間每隔10天對試驗豬的PCVAD癥狀進行評分。為了驗證評分的準確性，還對試驗豬進行了剖檢。采集了不同日齡活豬的血清樣本，以及剖檢豬的組織樣本，針對PCV2病毒血癥、PCV2抗體、豬繁殖呼吸綜合征病毒、豬肺炎枝原體Mycoplasma hyopneumoniae以及胸膜肺炎放線桿菌Actinobacillus pleuropneumoniae進行了測定。經(jīng)證實，b型PCV2是導致PCVAD的病原；研究涉及的其它病原與之無關。

　　無PCVAD癥狀的豬體重顯著比患豬更高（出生、斷奶、60日齡和180日齡時體重分別高0.22、1.12、6.6、46.0磅）。PCVAD評分的遺傳力為16％± 4％。試驗豬飼養(yǎng)的位置因素造成了PCVAD評分22％的變異。幾乎所有的豬90日齡之前都沒有出現(xiàn)病毒血癥，但斷奶和60日齡時許多豬出現(xiàn)了抗體?？磥磉@些母源抗體在大約90日齡以內(nèi)能夠保護豬只免遭PCVAD侵害。90日齡病毒血癥水平的遺傳力高于125日齡（分別為38 ± 11％和11 ± 8％）。90日齡（h2 = 55 ± 21％）和125日齡（h2= 10 ± 8％）抗體滴度均存在遺傳變異。
PCVAD的發(fā)病率與體重、PCV2病毒血癥水平、PCV2抗體滴度相關，并且這種相關受遺傳因素的影響。對PCVAD評分進行直接選育的效果預期會非常低（-0.89％每代），然而，如果采用育種指數(shù)，對65日齡體重、90日齡PCV2病毒血癥水平和抗體滴度進行綜合選育，則每代改進可達-8.0％，這比直接選育的效果要高998％。通過基因組選擇降低PCVAD發(fā)病率是可行的。

介紹

豬圓環(huán)病毒相關疾病（PCVAD）是由豬圓環(huán)二型病毒（PCV2）導致的，這類疾病會給養(yǎng)豬生產(chǎn)帶來很大的經(jīng)濟損失。內(nèi)布拉斯加大學林肯試驗豬群首先于2002年出現(xiàn)了PCVAD的癥狀。該豬場并非所有的豬都受到感染，而且發(fā)病率與豬的遺傳品系、所處的位置以及季節(jié)因素有關。雜交豬的發(fā)病率非常低，但內(nèi)布拉斯加大學（UNL）針對窩產(chǎn)仔數(shù)選育的品系當中感染個體明顯更多。有的個體看來對這種病很敏感，而同欄的其它個體卻仍然健康，無任何癥狀。

通常地，同一欄位當中只有一、兩頭豬發(fā)病，但有時某一窩豬會出現(xiàn)較高的發(fā)病率，即使分養(yǎng)在不同位置也是一樣，這種現(xiàn)象也很常見。

　　這個現(xiàn)象說明，豬對PCV2病毒的免疫反應存在遺傳變異。另一家科研機構對PCVAD的研究結果也支持這項假說，因為不同雜交方案生產(chǎn)的后代發(fā)病率也存在差異。然而，該項研究的樣本量太小，無法確定PCVAD發(fā)病率以及PCV2病毒免疫反應的遺傳變異（遺傳力）。假如遺傳變異足夠大，那么就有可能通過選育來提高豬對PCV2病毒的抵抗力，降低PCVAD的發(fā)病率。如果在核心群當中進行這種選育，那么高抗病力的性狀就可以沿著繁育金字塔傳遞到商品代豬群，這樣就有可能降低對免疫接種的依賴。

　　本文作者于是開展了一項研究，對豬進行系統(tǒng)的PCVAD評分、稱重并采集血樣，建立數(shù)據(jù)庫用于遺傳分析。因為PCVAD的表現(xiàn)常受繼發(fā)病原的影響，所以研究當中還對豬繁殖呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬肺炎支原體Mycoplasma hyopneumoniae和胸膜肺炎放線桿菌Actinobacillus pleuropneumoniae等病原進行了測定，以便確定這些病原是否影響了PCVAD的表現(xiàn)。

　　試驗豬來自第24至26代的UNL選育品系2系和45系，對照品系來自16系和61系，這些品系來自1979年形成的一個大白-長白雜交品種。2系和45系的選育方向為提高窩產(chǎn)仔數(shù)（1至20代）、提高增重速度和降低背膘厚（21至27代）。16系和61系為隨機選擇。各品系每代保持40至45窩的規(guī)模。2系和16系為7月和8月產(chǎn)仔（標記為同齡組1，CG1），45系和61系1月和2月產(chǎn)仔（CG2）。

飼養(yǎng)管理、PCVAD評分以及血清采樣

分娩兩天之內(nèi)實行了寄養(yǎng)，既有品系內(nèi)寄養(yǎng)也有品系間寄養(yǎng)。寄養(yǎng)無法做到對各個窩次完全一致。對窩產(chǎn)仔總數(shù)、窩產(chǎn)活仔數(shù)、產(chǎn)仔總數(shù)（n=3,440）、斷奶體重（n=3,438），以及寄養(yǎng)后窩仔數(shù)和每頭寄養(yǎng)母豬斷奶仔豬數(shù)（NW）等數(shù)據(jù)進行了記錄。

　　仔豬大約17日齡斷奶，斷奶后按日齡分群，每欄30頭。在60至65日齡上，從2系和45系窩產(chǎn)仔數(shù)前15名當中每窩選出四頭公豬，從前20名中每窩選出四至五頭母豬，作為候選種豬。從16系和61系的每頭種公豬的后裔當中隨機選出兩頭公豬，每窩當中隨機選出一至兩頭母豬，作為候選種豬。180日齡時進行最后選種。

　　所有候選種豬都養(yǎng)在六棟豬舍當中，每棟八個欄位，每欄10頭，這些豬舍為封閉式，機械通風，標記為位置1。其余豬只分養(yǎng)在三個不同的位置。位置2有25個欄位，每欄10頭豬，為封閉式豬舍，自然通風，靠窗上的溫控卷簾調(diào)節(jié)通風量。位置3有23個欄位，每欄10頭豬，為封閉式豬舍，采用自然通風，人工調(diào)節(jié)門窗控制通風量。位置4為舍外飼養(yǎng)場，安置了小型豬棚，豬棚中有秸稈墊料。每個飼養(yǎng)場50至60頭豬。CG1的豬養(yǎng)在位置1、2、3；CG2的豬養(yǎng)在位置1、2、4。

　　首次觀察到PCVAD癥狀是在2002年（21代）。經(jīng)過此后幾年的觀察，研究人員決定收集數(shù)據(jù)進行遺傳分析。在24、25和26代當中，對豬進行系統(tǒng)地稱重、PCVAD評分并采集血樣。轉(zhuǎn)入肥育舍時對2,646頭豬進行了65日齡稱重（有些個體未稱重），180日齡時又稱重（n=3,115）。從轉(zhuǎn)入肥育舍第七天開始，每隔7至10天針對PCVAD癥狀進行一次評分，直至180日齡稱重為止，每頭豬大約有10個評分。無癥狀的豬評分為0，輕微癥狀為1，明顯癥狀為2。評分根據(jù)肌肉消瘦、生長受阻、被毛粗糙、腹瀉以及呼吸困難程度進行。評分為1、2的個體被視為PCVAD陽性。

　　對25代CG2、26代CG1和CG2的所有個體都分別于60、90和125日齡采集了血樣。25代CG2斷奶時也采了血樣，26代CG1斷奶時對母豬也采了血樣。對所有PCVAD評分為2的個體、同欄隨機選擇的一頭0分個體、不同欄全同胞個體，以及同日齡組當中未出現(xiàn)PCVAD陽性的窩中隨機選擇的兩頭個體測量了PCV2病毒血癥水平，該指標可以反映病毒在豬體內(nèi)復制的能力。血清送交依阿華州Ames的依阿華州立大學獸醫(yī)診斷實驗室進行檢測，在那里進行了PCV2 C-ELISA PCR試驗和PCV2病毒定量（qPCR）試驗，以便確定PCV2病毒血癥以及抗體水平。

　　還針對豬肺炎支原體Mycoplasma hyopneumoniae（MH）、胸膜肺炎放線桿菌Actinobacillus pleuropneumoniae （APP）以及豬繁殖呼吸綜合征病毒（PRRSV）等病原對血清子樣本進行了ELISA（酶聯(lián)免疫吸附試驗）試驗。來自25代CG2組90日齡（n=261）和125日齡（n=228）的樣本檢測了MH；125日齡25代CG2組（n=228）和26代CG1與CG2組（n=511）的樣本檢測了APP。UNL豬群當中無PRRSV。為了證實這一點，從24至26代當中隨機抽取了52頭豬檢測了PRRSV。

　　從24代CG1（n=10）和CG2（n=11）、25代CG2（n=17）抽取了2分樣本，并從25代CG2當中隨機抽取了11頭0分樣本進行了剖檢。剖檢樣本來自各個位置，而且均來自不同的窩。取這些豬的肺、頸淋巴結、腸系膜淋巴結、扁桃體、腎臟和回腸等組織，針對PCV2進行了免疫組化和RT-PCR試驗。取五頭豬的鼻腔涂樣進行了RT-PCR試驗；其中兩頭未發(fā)現(xiàn)PCVAD相關損傷。剖檢和RT-PCR在內(nèi)布拉斯加大學獸醫(yī)與生物醫(yī)學系獸醫(yī)診斷中心進行。還通過ELISA試驗對這些豬進行了PRRSV抗體檢測。在剖檢并確診為PCVAD的個體中取三個血清樣本送交依阿華州Ames的依阿華州立大學獸醫(yī)診斷實驗室，在那里進行了豬圓環(huán)二型病毒C-ELISA PCR試驗，這是PCV2的定量試驗，可對病毒基因進行定序，以便確定豬群中流行的PCV2病毒的特別堿基序列。

統(tǒng)計過程
　　數(shù)據(jù)分析采用了適合于遺傳分析的統(tǒng)計過程。兩個性狀均為二項式分布，因為結果要么為是，要么為否，編碼為0和1。一個性狀是PCVAD評分（1=陽性，0=陰性），另一個性狀為病毒血癥（0=無病毒復制，1=發(fā)生病毒復制，病毒血癥水平高于0）。對于存在病毒血癥（編碼為１）的個體，病毒血癥水平（每毫升基因組數(shù)）用log10表示，以便對分布進行正態(tài)化。PCV2抗體滴度和體重均為正態(tài)分布。

　　表1給出了性狀的描述以及記錄數(shù)。表2給出了PCVAD評分、PCV2病毒血癥和PCV2的聯(lián)合分布。遺傳分析采用的系譜文件當中有12,032頭豬，其中包括了本研究用到的個體，及其上溯到第一代所有祖先個體當中有表型數(shù)據(jù)的個體。分析的性狀包括PCVAD評分、出生重、斷奶重、65日齡重、180日齡重、90日齡和125日齡病毒血癥評分（編碼0、1）、病毒血癥評分陽性個體90日齡和125日齡病毒血癥水平的log10，以及60、90和125日齡PCV2的抗體滴度?？贵w滴度大于或等于.5者視為陽性，說明豬接觸過病毒，滴度.2至.49為疑似范圍，低于.2者視為陰性。
結果觀察與固定效應

總體來看，14.4％的個體至少得到過一次陽性PCVAD評分，但不同代之間發(fā)病率差異很大（圖 1）。陽性評分個體的死亡率為35.4％．不同品系間PCVAD發(fā)病率差異不顯著。

圖 1. PCVAD陽性評分百分比例

60日齡采集的血清樣本當中，PCV2病毒血癥結果幾乎全部（94.6％）為陰性，因此未對60日齡的病毒血癥數(shù)據(jù)進行分析。26代CG2組90日齡采集的血清樣本病毒血癥結果除2例為陰其余均為陽（表 2），因此該組數(shù)據(jù)也從分析當中剔除。斷奶仔豬血清樣本病毒血癥結果除兩例為陰性以外，其余均為陽性，但其母系77頭母豬當中有37頭為陽性。母豬和后裔的抗體平均滴度分別為1.07 ± 0.15和0.90 ± 0.16。

圖 2示各同齡組60、90和125日齡時的PCV2抗體滴度。25代CG2和26代CG1的60和90日齡抗體滴度相似，26代最高。

圖 2. PCV2抗體滴度均值

不同世代、同齡組和日齡之間病毒血癥的出現(xiàn)頻率差異很大（圖 3）。在26代CG2，53.9％的個體90日齡時未出現(xiàn)病毒血癥，但抗體滴度卻高于0.5（表 2）。其它各組僅有5.9％的個體未出現(xiàn)病毒血癥卻表現(xiàn)高抗體滴度。26代CG2當中60.8％的個體未表現(xiàn)病毒血癥，同時抗體滴度低于0.2，而其它各組當中這樣的個體僅占10.2％的比例。

圖 3. 90和125日齡病毒血癥的比例

PCVAD的發(fā)病率雄性高于雌性，并且雄性60（0.03）和90日齡（0.05）的PCV2抗體滴度更高（P<0.05）。90日齡出現(xiàn)病毒血癥的概率雌性低于雄性（-0.30, P<0.05）。

PCVAD評分為0的個體出生、斷奶、65日齡和180日齡的體重（分別高0.22、1.12、6.6和46.0磅）均高于1分個體（P<0.0001）。并且0分個體90日齡（相差0.26±0.15）和125日齡（相差0.85±0.12）的病毒血癥水平低于1分個體，抗體滴度高于1分個體（分別相差0.04±0.01和0.05±0.02）。

PCV2定序

進行PCV2 mRNA定序的三頭豬結果均為PCV2b基因型陽性。其中一頭豬的基因序列與國家生物技術信息庫當中收錄的先前檢測過的一種病毒100％一致。另兩頭豬的結果未與數(shù)據(jù)庫中的任何病毒基因序列完全相同。其中一個在116位點上存在一個單堿基變異（G變?yōu)锳）；另一個在116（G變?yōu)锳）和465（C變?yōu)镚）位點上存在兩個單堿基變異。試驗結果證實，PCV2b確實是本豬群中PCVAD的致病病原，但該病毒發(fā)生了突變，造成核苷酸系列與先前檢測到的病毒之間存在輕微變異。

剖檢結果

38頭PCVAD陽性個體當中，36頭的組織樣本也呈PCV2病毒陽性。其余兩頭組織樣本呈陰性，但鼻腔涂樣呈陽性。PCVAD陰性的11頭豬組織檢測結果均為陰性。PCVAD陽性豬表現(xiàn)出嚴重的消耗性體質(zhì)、體重喪失、被毛粗糙、腸系膜淋巴結腫大，存在肺炎損傷，以及慢性大腸炎。觀察到腸系膜淋巴結淋巴細胞減少，淋巴濾泡、脾小結和集合淋巴結當中出現(xiàn)巨細胞，以及淋巴細胞減少造成的胸腺萎縮。19頭豬有豬肺炎支原體癥狀；18頭豬有豬鏈球菌Streptococcus suis癥狀，4頭有細胞內(nèi)羅松菌Lawsonia intracellularis癥狀。

ELISA排查

所有試驗血清的PRRSV和豬肺炎支原體結果均為陰性。25代CG2當中125日齡采集的228個血清樣本當中有32個APP呈陽性。26代90日齡采集的513個血清樣本中有21個APP呈陽性，16個滴度疑似，其余為陰性。APP陽性的八頭豬和疑似的五頭豬PCVAD評分為陽性。然而，142頭PCVAD陽性的豬APP為陰性。這樣的話，可以排除PRRSV和豬肺炎支原體作為繼發(fā)病原的可能，而APP也不大可能作為繼發(fā)病原影響PCVAD在本豬群當中的表現(xiàn)。

遺傳與環(huán)境因素

PCVAD評分和體重方面遺傳因素和環(huán)境因素變異占總變異的百分比參見表3，PCV2病毒血癥和抗體滴度方面的變異參見表4。PCVAD評分的直接遺傳力為16 ± 4％，這個指標可衡量豬的基因的相對重要性。體重方面，斷奶體重的遺傳力為16％，出生體重的遺傳力為27％。母系的基因、母系遺傳力對出生和180日齡體重具有重要影響。飼養(yǎng)位置構成了PCVAD評分的最大變異，而若干個環(huán)境因素則在體重變異當中占主要比重。對于病毒血癥陽性的個體來說（病毒血癥水平高于0），90日齡病毒血癥水平的估計遺傳力要高于125日齡（分別為38 ± 11％和11 ± 8％）?？贵w滴度在125日齡存在遺傳變異（h2 = 10 ± 8％），而當全部數(shù)據(jù)都投入分析的情況下90日齡抗體滴度則不存在遺傳變異。然而，如果把26代CG2的數(shù)據(jù)剔除，那么90日齡PCV2抗體滴度的遺傳變異就很高（h2=55 ± 21％）。90日齡和125日齡病毒血癥評分的變異大部分是由位置以及豬舍造成的。而這方面的因素對病毒血癥水平和抗體滴度變異的影響則相對較小。

對這些性狀之間的遺傳相關和殘余相關進行了計算，但本文不做逐一陳述。重要的相關包括，PCVAD評分與90日齡病毒血癥（rg = 0.75）與抗體水平（rg = -0.67）之間存在相當高的遺傳相關，與65日齡體重之間存在中度相關（rg = -0.53）。而出生重和斷奶重與病毒血癥和抗體水平之間均不存在顯著遺傳相關。然而，斷奶重與125日齡病毒血癥之間存在高度遺傳相關，180天體重與90和125日齡病毒血癥之間存在高度遺傳負相關，與90日齡抗體滴度之間存在正相關。90與125日齡抗體滴度之間存在遺傳正相關（rg=0.59），90日齡病毒血癥與抗體滴度之間存在負相關（rg=-0.51）。90與125日齡抗體滴度之間存在正相關（rg=0.59）。

盡管有些性狀間存在顯著環(huán)境相關，但都不是很強。最明顯的是，PCVAD評分與65日齡內(nèi)的體重之間存在環(huán)境相關（-0.47e=-0.38），90日齡病毒血癥與體重之間存在負相關（-0.26 < re < -0.16）。

討論

總結本次研究以及其它文獻的成果，作者得出結論，PCVAD發(fā)病率和PCV2免疫反應指標方面存在遺傳變異。PCVAD評分的遺傳力為16％，90日齡病毒血癥和抗體水平的遺傳力分別為38％和55％。125日齡病毒血癥和抗體水平的遺傳變異較低，并不顯著，這可能是因為90日齡至125日齡之間有PCVAD患豬死亡，造成記錄減少，從而遺傳變異在存活下來的豬當中變得不顯著。

　　90日齡病毒血癥和抗體水平以及65日齡體重與PCVAD評分之間存在相當高的遺傳相關。因此，針對這些性狀進行選育有可能能夠有效降低PCVAD的發(fā)病率。對不同的選種策略計算了預期的選種效果。這些策略包括 1）直接選種 - 僅自從未表現(xiàn)過PCVAD癥狀的個體當中選留種豬，2）針對體重、病毒血癥或抗體水平等性狀進行單性狀選種，以及 3）采用相關性狀或PCVAD評分結合相關性狀進行指數(shù)選種。

　　盡管PCVAD評分是可遺傳的，但直接選種的效率相對較低，PCVAD發(fā)病率每代僅能降低0.8％。原因是，評分為0的個體比例高達85％，而這些個體都可以成為候選個體，選擇率過低。其它性狀呈連續(xù)分布，因此個體會在整個分布范圍內(nèi)變異。假如選留90日齡PCV2抗體滴度最高的10％的公豬和30％的母豬，那么就可以獲得最高的單性狀選種效果（1代的選種效果 = -6.5％）。如果采用65日齡體重、90日齡病毒血癥和抗體滴度這三個指標建立選種指數(shù)，則可獲得最佳的遺傳效果（-8.0％）。如果這三個性狀之外再加上PCVAD評分建立四性狀指數(shù)，預期每代選種效果與前者相同。通過相關性狀進行指數(shù)選種的效果比直接選種的效果好414％至998％。

　　剖檢結果證實，在本群當中PCV2是PCVAD的主要致病病原。PCV2基因分析現(xiàn)實，病原多半是PCV2b。然而，至少有三種不同形式的基因存在，并且可能會更多。因此，PCV2b的基因組發(fā)生了突變，但這種突變會造成什么樣的后果尚未可知。

　　本研究中，豬繁殖呼吸綜合征病毒、豬肺炎支原體Mycoplasma hyopneumoniae和放線桿菌胸膜肺炎Actinobacillus pleuropneumoniae并非影響PCVAD病情的繼發(fā)病原。其它研究發(fā)現(xiàn)，PCV2和格蘭氏陰性細菌的混合感染會誘發(fā)PCV2病毒的復制。本次研究中并未針對這些病原進行診斷，但已知本群當中存在諸如大腸桿菌Escherichia coli、流感嗜血桿菌Haemophilus influenzae、格蘭氏陰性細菌等病原，這種情況可能增加了PCVAD的發(fā)病風險。

　　90日齡PCV2病毒血癥水平與PCVAD發(fā)病率之間存在強相關。26代CG2的PCVAD評分陽性率為3.9％，而這些豬90日齡表現(xiàn)病毒血癥的比例只有1％。25代CG2和26代CG1的PCVAD發(fā)病率高于93％，二者病毒血癥陽性比例分別為75％和93％。

　　PCVAD陽性豬在出生重、斷奶重、65日齡體重和180日齡體重等方面均表現(xiàn)出差異，盡管有些體重測量的時間遠早于PCVAD癥狀出現(xiàn)的時間。PCVAD評分與出生和斷奶體重之間存在正遺傳相關，但不顯著。然而，環(huán)境相關為負相關，且顯著，這說明表型的變異很大程度是由環(huán)境影響造成，這些環(huán)境影響會降低早期體重，增加PCVAD發(fā)病風險。

　　豬斷奶時抗體滴度均值高，這多半是母源PCV2抗體造成的，因為這些豬均未表現(xiàn)病毒血癥。斷奶至60日齡之間抗體滴度下降，但60日齡病毒血癥陰性的比例仍高達94.6％。60至90日齡期間抗體滴度繼續(xù)下降，說明母源抗體正在消失。出生窩次的不同是造成60和90日齡抗體滴度變異的主要原因，這進一步證明母源抗體方面存在顯著的變異。其它研究已經(jīng)顯示，母源PCV2抗體滴度高總的來說可針對PCV2病毒起到保護作用，反之則沒有保護作用；然而，母源抗體并不能完全預防PCV2病毒感染。這樣看來，在我們的這項研究當中，母源抗體至少在60日齡上起到了部分的保護作用。

意義

PCV2免疫反應是可遺傳的。因此，有可能通過遺傳選育來降低PCVAD發(fā)病率。盡管遺傳進展是肯定的，但要想大幅降低發(fā)病率，需要若干代的選育才能實現(xiàn)，而且選育必須在核心群進行，然后沿繁育金字塔傳遞到商品豬群。因此，通過這種策略降低商品群的PCVAD發(fā)病率需要相當長的時間。

　　此外，只有在核心群存在PCV2病毒感染的情況下才有可能針對PCVAD評分、病毒血癥和抗體水平進行選育，只有這樣各性狀的遺傳變異才能體現(xiàn)出來。通過基因標記輔助進行基因組選育可能會更有效，因為一旦確定了與各個效果變量相對應的標記基因，那么就可以在無PCV2病毒的情況下對任豬群進行選種。

　　從長遠來看，將PCV2抵抗力與PCVAD發(fā)病率降低相結合的基因組選育可能是最有效的育種方案。

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