復(fù)合酶制劑體外酶解小麥的研究-

llppaa

　　呂景智
　　酶制劑在動(dòng)物飼養(yǎng)中的作用效果已得到廣泛認(rèn)可，但飼養(yǎng)試驗(yàn)耗時(shí)長(zhǎng)、費(fèi)用高，影響因素多，效果不穩(wěn)定。胃蛋白酶-胰蛋白酶兩步消化法是用來(lái)體外測(cè)定動(dòng)物對(duì)飼料的消化率，與體內(nèi)測(cè)定法相比，該法快速、方便且費(fèi)用不高，測(cè)定準(zhǔn)確。
　　本試驗(yàn)在小麥中添加不同劑量的復(fù)合酶制劑，利用胃蛋白酶和胰蛋白酶將樣品蛋白模擬體內(nèi)消化，研究其對(duì)飼料養(yǎng)分消化率、黏度、還原糖含量的影響，為推廣酶制劑在生產(chǎn)實(shí)踐中的合理應(yīng)用提供依據(jù)。
　　1 材料和方法
　　1.1 試驗(yàn)材料
　　小麥來(lái)源于北方小麥，粉碎過(guò)40目篩,置于棕色試劑瓶中，于干燥處儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?br /> 　　復(fù)合酶制劑由法國(guó)安迪蘇公司生產(chǎn)，主要含纖維素分解酶、木聚糖酶、葡聚糖酶、阿拉伯呋喃糖酶、蛋白酶等。
　　胃蛋白酶(AR)由上海捷倍思基因技術(shù)有限公司生產(chǎn)。
　　胰蛋白酶(AR)由上海邦成生物科技有限公司生產(chǎn)。
　　1.2 試驗(yàn)方法
　　稱取15份20.0 g已粉碎的樣品,分別放入300 ml的三角瓶中，另加0、0.25%、0.5%、1%、2% 5個(gè)水平的復(fù)合酶制劑，分別為對(duì)照組、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組，每個(gè)處理組做3個(gè)重復(fù)(三角瓶封口)。每個(gè)樣品加入60 ml胃蛋白酶液(4 mg/ml)，用0.075 mol/l HCl溶液將pH值調(diào)至2.5,在溫度為40 ℃、振蕩速率為50 r/min的恒溫振蕩器上消化4 h,然后加入60 ml胰蛋白酶液(2 mg/ml),用0.1 mol/l NaOH溶液將pH值調(diào)至7.0,在上述相同條件下再消化4 h。消化結(jié)束后,用濾紙過(guò)濾消化物,并沖洗3～4次,未消化部分再在60 ℃下烘干,稱重并儲(chǔ)存。
　　1.3 測(cè)定指標(biāo)
　　1.3.1 測(cè)定殘?jiān)叙B(yǎng)分的消化率
　　養(yǎng)分消化率(%)=[原樣重(g)×養(yǎng)分含量(%)-殘余樣重(g)×養(yǎng)分含量(%)]/[原樣重(g)×養(yǎng)分含量(%)]。
　　干物質(zhì)含量的測(cè)定采用常壓干燥法。
　　粗蛋白含量的測(cè)定采用半微量凱氏定氮蒸餾法。
　　粗脂肪含量的測(cè)定采用索氏脂肪抽提法。
　　1.3.2 體外消化濾液黏度測(cè)定
　　取濾液150 ml，在40 ℃ 下預(yù)熱5 min，用黏度計(jì)(選用零號(hào)轉(zhuǎn)子60 r/min)測(cè)定其黏度，讀取絕對(duì)黏度的數(shù)值。
　　1.3.3 還原糖的測(cè)定
　　1.3.3.1 DNS試劑的配制
　　稱取91.0 g的酒石酸鉀鈉，溶解于500 ml水中，加入3，5-二硝基水楊酸3.15 g、NaOH 10.5 g ,不斷攪拌，并小心加熱，控制溫度在45 ℃內(nèi)，再加入2.5 g苯酚和2.5 g亞硫酸鈉攪拌均勻，冷卻至室溫后定容至1 000 ml，貯于棕色試劑瓶中，放置1周備用。
　　1.3.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的確定
　　準(zhǔn)確稱取100 mg的無(wú)水葡萄糖(分析純)(預(yù)先在105 ℃干燥至恒重)，用少量蒸餾水溶解后，轉(zhuǎn)移到100 ml容量瓶中，定容至刻度，搖勻，濃度為1 mg/ml。取8只25 ml刻度的試管，分別按表1設(shè)計(jì)添加試劑。將各管混合均勻，在沸水浴中加熱5 min，取出后立即冷卻至室溫，再向每管中加入21.5 ml蒸餾水，搖勻，于520 nm 波長(zhǎng)處測(cè)OD值。
　　其中還原糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為 y=0.692 x+0.152(y為吸光度值、x為還原糖量)，相關(guān)系數(shù)r=0.998。
　　1.3.3.3 還原糖的提取與測(cè)定
　　將處理后的樣品液過(guò)濾，濾液收集到50 ml的容量瓶中，并定容至50 ml。
　　取4支50 ml容量瓶按表2設(shè)計(jì)加入試劑,將各管溶液混合均勻,在沸水浴中加熱5 min,取出后立即冷卻至室溫,再向每管加入蒸餾水至50 ml,搖勻,于520 nm波長(zhǎng)處測(cè)OD值。測(cè)定后，取樣品的平均OD值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的還原糖量。
　　1.4 數(shù)據(jù)處理
　　采用SPSS11.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸、方差分析和多重比較。
　　2 結(jié)果與分析(見(jiàn)表3)
　　2.1 復(fù)合酶制劑對(duì)小麥體外養(yǎng)分消化率的影響
　　由表3可見(jiàn)，干物質(zhì)的消化率隨著復(fù)合酶制劑添加量的增加而提高，但各組間差異不顯著(P>0.05)。復(fù)合酶制劑添加量為0.25%時(shí)粗脂肪的消化率達(dá)到最高，與對(duì)照組相比提高了6.71個(gè)百分點(diǎn),Ⅰ組與對(duì)照組、Ⅱ組、Ⅲ組和Ⅳ組組間差異極顯著(P<0.01),Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ組組間差異不顯著(P>0.05)。粗蛋白的消化率在復(fù)合酶制劑添加量為0.5%時(shí)達(dá)到最高,對(duì)照組和Ⅰ組與Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組相比組間差異極顯著(P<0.01)，而Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組組間無(wú)顯著差異(P>0.05)。
　　2.2 復(fù)合酶制劑對(duì)小麥體外消化濾液黏度的影響
　　由表3可見(jiàn),消化濾液的黏度隨著復(fù)合酶制劑添加量的增加而降低,對(duì)照組、Ⅰ組與Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組相比差異極顯著(P<0.01);Ⅱ組與Ⅲ組、Ⅲ組與Ⅳ組相比差異顯著(P<0.05)。
　　2.3 復(fù)合酶制劑體外酶解對(duì)小麥中還原糖含量的影響
　　從表3可以看出，復(fù)合酶制劑添加量在0.25%、0.5%(Ⅰ、Ⅱ組)時(shí),小麥中還原糖含量分別比對(duì)照組提高38.32、52.67 mg,與對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)。且復(fù)合酶制劑添加量在0.5%時(shí)，小麥中還原糖含量達(dá)到最高，為121.98 mg。Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組小麥中還原糖含量各組間差異不顯著(P>0.05)。
　　3 討論
　　3.1 隨著復(fù)合酶制劑添加量的增加，干物質(zhì)、粗蛋白、粗脂肪的消化率都有不同程度的提高,尤其是粗蛋白的這種變化趨勢(shì)更為明顯。復(fù)合酶制劑中的阿拉伯木聚糖酶、β-葡聚糖酶、甘露聚糖酶、纖維素酶和果膠酶可使細(xì)胞壁中的阿拉伯木聚糖、β-葡聚糖、甘露聚糖、纖維素和果膠降解成一些小分子的片段，使細(xì)胞壁NSP、木質(zhì)素、蛋白質(zhì)、脂類物質(zhì)和礦物質(zhì)組成的復(fù)雜交聯(lián)結(jié)構(gòu)受到破壞，促進(jìn)細(xì)胞壁崩解，充分釋放細(xì)胞壁包裹的各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而提高各種養(yǎng)分的消化率。
　　3.2 小麥中水溶性非淀粉多糖的抗?fàn)I養(yǎng)作用主要是由水溶性非淀粉多糖提高了食糜的黏度引起的(Pettersson等，1998)。Choct等(1990)認(rèn)為，小麥戊聚糖抗?fàn)I養(yǎng)作用的機(jī)制是使食糜黏度升高。目前降低飼料NSP含量最行之有效的方法是在畜禽飼料中添加木聚糖內(nèi)切酶或葡聚糖內(nèi)切酶，以破壞NSP的大分子結(jié)構(gòu)，降低其黏度。本試驗(yàn)中添加的復(fù)合酶制劑組分中木聚糖酶活性相對(duì)較高，對(duì)降解木聚糖為低聚糖的能力較強(qiáng)。而復(fù)合酶制劑中含有較高的木質(zhì)素降解成分(如漆酶、錳過(guò)氧化物酶)，因此，所測(cè)得的消化液的黏度呈現(xiàn)出明顯的下降趨勢(shì)。
　　3.3 還原糖含量隨酶制劑添加量的升高呈先上升后緩慢下降的趨勢(shì)，在0.5%時(shí)達(dá)到最高。這是因?yàn)殡S著復(fù)合酶制劑對(duì)小麥中養(yǎng)分的分解，消化產(chǎn)物濃度逐漸升高，當(dāng)酶的濃度達(dá)到最適濃度后，酶的作用效果趨于平緩，此時(shí)隨著酶添加量的增加，酶的作用效果減弱。這說(shuō)明了酶的作用效果受酶添加量的影響，添加量不足或過(guò)多都會(huì)影響到酶的最佳作用效果。

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