雞傳染性喉氣管炎診斷技術(shù)

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雞傳染性喉氣管炎診斷技術(shù)

NY/T 556—2002
前言
雞傳染性喉氣管炎是雞的重要疫病之一，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織[World Organization for Animal Health(英)，Office Intentional des Epizootic(法)，OIE]將本病定為B類動(dòng)物疾病，我國定為二類動(dòng)物疫病。
本標(biāo)準(zhǔn)主要參照OIE推薦的雞傳染性喉氣管炎(ILT)診斷方法制定。
本標(biāo)準(zhǔn)的附錄A、附錄B為規(guī)范性附錄。
本標(biāo)準(zhǔn)由農(nóng)業(yè)部畜牧獸醫(yī)局提出。
本標(biāo)準(zhǔn)由全國動(dòng)物檢疫標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。
本標(biāo)準(zhǔn)起草單位:農(nóng)業(yè)部動(dòng)物檢疫所。
本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人:范根成、王永玲、劉相娥、王紅。
1范圍
本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了雞傳染性喉氣管炎病毒分離及瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散試驗(yàn)的技術(shù)要求。
本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的病毒分離技術(shù)，適用于本病的確診。瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散試驗(yàn)，適用于傳染性喉氣管炎的血清學(xué)診斷及用傳染性喉氣管炎疫苗免疫后的抗體檢測。
2病毒分離鑒定技術(shù)
2.1材料準(zhǔn)備
2.1.1病料的準(zhǔn)備
2.1.1.1活體采樣:用滅菌棉拭子伸入口咽或氣管采集分泌物，放入含青霉素4000 IU/mL，鏈霉素4000 μg//mL的無菌生理鹽水中。也可用棉拭子刮取眼分泌物，處理方法同上。
2.1.1.2尸體采樣:無菌采取病死雞喉頭和氣管，放入無菌的平皿或燒杯中，密封。
2.1.2樣品的運(yùn)送。
采集的樣品應(yīng)立即放入4℃冰箱保存，24h內(nèi)送到實(shí)驗(yàn)室；不能在24h內(nèi)送到實(shí)驗(yàn)室時(shí)，應(yīng)將所采樣品冷凍保存和運(yùn)輸。2.1.3樣品處理
2.1.3.1收到棉拭子樣品后，先經(jīng)凍融兩次，并充分振動(dòng)、擠干棉拭子，將樣品液經(jīng)10000 r/min離心10min，取上清液，加入青霉素4000 IU/mL、鏈霉素4000 μg//mL，于37℃作用30min，作為接種材料。
2.1.3.2組織樣品:無菌條件下將組織剪碎，按1:4加入生理鹽水后用研磨器研磨制成20%的勻漿懸浮液，再經(jīng)10000 r/min離心10 min ，取上清液，加入青霉素4000 IU/mL，鏈霉素4000μg//mL，于37℃作用30min ，作為接種材料。
2.2操作方法
2.2.1樣品接種
取經(jīng)處理過的樣品，接種9～12日齡的雞胚絨毛尿囊膜。每枚0.2mL，接種后的雞胚在37℃孵育，每天觀察雞胚2次，連續(xù)觀察7d ，棄去24h內(nèi)死亡的雞胚，24h～120h內(nèi)死亡的雞胚，放4℃冷卻后，觀察雞胚絨毛尿囊膜上有無痘斑形成；120 h仍不死亡的雞胚，亦取出，置4℃冷卻后，觀察雞胚絨毛尿囊膜上有無痘斑形成。有痘斑者，取出雞胚絨毛尿囊膜和尿囊液，無菌研磨后，置－20℃凍存?zhèn)溆?；無痘斑者，亦取出雞胚絨毛尿囊膜和尿囊液，無菌研磨，反復(fù)凍融，離心后，接種9～12日齡的雞胚絨毛尿囊膜盲傳。如此盲傳3代以上，如仍無病變，則判為雞傳染性喉氣管炎陰性。
2.2.2病毒鑒定
病毒分離物的鑒定:用雞傳染性喉氣管炎標(biāo)準(zhǔn)陽性血清(效價(jià)在1:32以上)和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清與分離物作雞胚中和試驗(yàn)，固定血清，稀釋病毒法中和試驗(yàn)操作方法。
血清處理:將傳染性喉氣管炎標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清56℃滅活處理30min。
病毒稀釋:將病毒分離物用含青霉素1000 IU/mL、鏈霉素1000 μg/mL的滅菌生理鹽水稀釋，稀釋方法見表1。
表1病毒分離稀釋方法
管號(hào) 病毒分離物稀釋度 試管中的混合液
1 2×10-1 1mL病毒分離物愿液+4mL稀釋液
2 2×10-2 1mL2號(hào)管液+9mL稀釋液
3 2×10-3 1mL3號(hào)管液+9mL稀釋液
4 2×10-4 1mL4號(hào)管液+9mL稀釋液
5 2×10-5 1mL5號(hào)管液+9mL稀釋液
病毒-血清混合液:設(shè)兩排試驗(yàn)管，每排4個(gè)管，第1排每管放0.6mL標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，第2排每管放0.6mL陰性血清，然后向每排1～4號(hào)試驗(yàn)管內(nèi)分別加入(2×10-2～2×10-5)稀釋的病毒懸液各0.6mL，將病毒-血清懸液混合并置冰箱(4℃～8℃)4h。
雞胚接種及結(jié)果判定:取經(jīng)處理過的病毒-血清混合液，分別接種9～12日齡的雞胚絨毛尿囊膜，0.2mL/枚，每管接種5枚，接種后的雞胚在37℃孵育，每天觀察雞胚2次，連續(xù)觀察7d，棄去24h內(nèi)死亡的雞胚，24h～120h內(nèi)死亡的雞胚，放4℃冷卻后，觀察雞胚絨毛尿囊膜上有無痘斑形成；120h仍不死亡的雞胚，亦取出，置4℃冷卻后，觀察雞胚絨毛尿囊膜上有無痘斑形成。記錄觀察結(jié)果，按半數(shù)致死量(Reed—Muench)方法計(jì)算EID50，計(jì)算方法見附錄A(規(guī)范性附錄)。
2.3結(jié)果判定
如分離物能引起雞胚絨毛尿囊膜出現(xiàn)典型的痘斑，并且經(jīng)雞胚中和試驗(yàn)，其陰性血清組和陽性血清組的EID50的對(duì)數(shù)之差大于或等于2.5時(shí)，則判定分離物為雞傳染性喉氣管炎病毒。
3瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散試驗(yàn)
3.1材料準(zhǔn)備
3.1.1器材:燒杯，直徑85mm培養(yǎng)皿，孔徑4mm的打孔器，6～9號(hào)針頭，微量移液器及針頭。
3.1.2瓊脂擴(kuò)散抗原。
3.1.3標(biāo)準(zhǔn)陽性血清。
3.1.4被檢血清:無菌采血，分離血清，4℃或-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 3.1.5瓊脂平板:配制方法見附錄B(規(guī)范性附錄)。
3.2操作方法
3.2.1瓊脂板打孔
在瓊脂糖平皿上，按坐標(biāo)紙上畫好的梅花型(見圖1)打孔，孔徑4mm，孔間距3mm。挑出孔內(nèi)瓊脂，在火焰上封底。
①?、?
⑥　⑦?、?br> ⑤?、?br> 圖1　　打孔樣式
3.2.2加樣
用微量移液器加樣，中央孔(7孔)加抗原，1、3、5孔加標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，2、4、6孔加待檢血清，每孔均以加滿不溢出為度。
3.2.3反應(yīng)
加樣完畢后，靜置10min ，放入37℃帶蓋的濕盒中反應(yīng)，分別在12h、24h、36h觀察并記錄結(jié)果。
3.3結(jié)果判定
3.3.1判定方法
將瓊脂板置暗背景或強(qiáng)光照射下觀察。標(biāo)準(zhǔn)陽性血清孔與抗原孔之間出現(xiàn)一條清晰的沉淀線，則試驗(yàn)成立；若無沉淀線或沉淀線不明顯，則試驗(yàn)不成立，應(yīng)重做。
3.3.2判定標(biāo)準(zhǔn)
3.3.2.1被檢樣品孔與中央孔之間形成清晰的沉淀線，并與標(biāo)準(zhǔn)陽性血清孔的沉淀線相融合者，為陽性。
3.3.2.2被檢血清孔與抗原之間不形成完整的沉淀線，但標(biāo)準(zhǔn)陽性血清孔與抗原孔之間的沉淀線末端向被檢血清孔的內(nèi)側(cè)彎曲看，為弱陽性。
3.3.2.3被檢血清孔與抗原之間無沉淀線，標(biāo)準(zhǔn)陽性血清孔與抗原孔之間的沉淀線直伸向被檢血清孔的邊沿?zé)o彎曲者，判為陰性。
3.3.2.4有的被檢血清與抗原之間可能出現(xiàn)兩條以上沉淀線，其中一條與標(biāo)準(zhǔn)陽性血清-抗原間沉淀線融合者判為陽性；均不融合者為陰性，此沉淀線為非特異性沉淀線。
附錄A
(規(guī)范性附錄)
雞胚半數(shù)感染量(EID50)測定方法(Reed-Muench法)
B.1定義
雞胚半數(shù)感染量(EID50)指能使50%雞胚感染的病毒量，常用Reed-Muench法計(jì)算。
B.2計(jì)算公式
按式(A.1)、式(A.2)計(jì)算:
lg EID50=高于50%死亡率的病毒稀釋度的對(duì)數(shù)+距離比例值×稀釋倍數(shù)的對(duì)數(shù)……………(A.1)
距離比例值=(高于50%死亡率-50%)/(高于50%死亡率-低于50%的死亡率) ……………(A.2)
B.3舉例
病毒毒價(jià)測定(接種數(shù)量0.1mL/枚)見表A.1。
表A.1
接種病毒稀釋 雞胚 累計(jì)數(shù) 死亡數(shù)/總數(shù)比例 死亡百分?jǐn)?shù)/%
死亡數(shù) 健活數(shù) 死 活
10-4 5 0 12 0 12/12 100
10-5 4 1 7 1 7/8 88
10-6 2 3 3 4 3/7 43
10-7 1 4 1 8 1/9 11
表中第1列為接種的稀釋度，第2列為死亡雞胚數(shù)，第3列為活雞胚數(shù)，后面的兩列分別是第2列和第3列的累計(jì)數(shù)。
距離比值=(88%-50%)/(88%-43%)=38/45=0.84
lg EID50=-5+0.84×(-1)=-5.84
EID50=10-5.84/0.1mL
附錄B
(規(guī)范性附錄)
瓊脂平板制備方法
用含8%氯化鈉的蒸餾水加萬分之一疊氮化鈉配制成1%瓊脂糖，103kPa高壓蒸汽滅菌或水浴加熱使瓊脂充分溶化，加入直徑為85mm的培養(yǎng)皿中，每皿16mL，平置，室溫下凝固后，置4℃?zhèn)溆谩?br>

蒙城獸醫(yī)

我一直想做，只是沒條件做，以前在學(xué)校實(shí)驗(yàn)室的時(shí)候沒有病料，現(xiàn)在有了病料卻沒有實(shí)驗(yàn)室。

xxc1963

對(duì)臨床獸醫(yī)幫助不大啊