飼料木聚糖酶的開發(fā)

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　　飼料木聚糖酶的開發(fā)
　　摘 要 木聚糖是動物飼料中的抗營養(yǎng)因子之一，飼料中添加木聚糖酶可以為畜禽生產帶來良好的生產效果和經濟效益，具有十分重要的理論和現(xiàn)實意義，開發(fā)木聚糖酶市場前景廣闊。文中簡單介紹了木聚糖酶及其在動物營養(yǎng)中的應用和飼料木聚糖酶開發(fā)的途徑;介紹了基因工程和蛋白質工程方法在木聚糖酶開發(fā)中的應用;重點介紹了蛋白質工程在開發(fā)熱穩(wěn)定性木聚糖酶方面的研究概況。
　　關鍵詞 木聚糖酶;飼料開發(fā);蛋白質工程
　　中圖分類號 S816.35
　　近年來，隨著人們對畜產品品質安全衛(wèi)生的要求，開發(fā)使用高品質無毒、無害和無污染殘留的綠色飼料添加劑已成為我國飼料工業(yè)面臨的一個緊迫問題。中國飼料產量位居世界第二，然而飼料資源并不豐富，其中能量飼料缺口較大，據預測2020年將達0.83億噸[1]。規(guī)?；B(yǎng)殖的發(fā)展，使充分利用非常規(guī)飼料資源成為畜牧業(yè)長期、持續(xù)和健康發(fā)展的關鍵。我國長期以玉米為主要能量飼料原料的現(xiàn)狀造成玉米供應日趨緊張，因此必須充分地開發(fā)利用資源豐富的麥類、谷物和糠麩。但麥類、谷物和糠麩等副產品中都存在抗營養(yǎng)因子——阿拉伯木聚糖，限制了其在飼料中的大量應用。
　　隨著生物技術的發(fā)展，飼用酶制劑和微生物制劑的產量得到了快速增長，質量也有了顯著提高，酶制劑可以提高飼料利用率、促進動物生長、改善生態(tài)環(huán)境和防治動物疾病，避免了由于添加抗生素、激素和高銅等物質所產生的負面影響，具有明顯的經濟效益和積極的環(huán)保意義。我國飼料行業(yè)，在配合飼料中除一般玉米—豆粕型日糧，實際上更多的情況是在玉米—豆粕型日糧基礎上可能加入10%~40%的大麥或小麥、次粉、麥麩、統(tǒng)糠、棉粕等非常規(guī)飼用原料，這使得木聚糖酶在飼料工業(yè)中占有重要地位[2]。另外，中國已加入WTO，國外低價格小麥、大麥產品的涌入，將進一步刺激木聚糖酶的市場需求。添加以木聚糖酶為主的飼用酶制劑，消除抗營養(yǎng)因子的抗營養(yǎng)作用，市場前景極為廣闊。
　　1 木聚糖酶的營養(yǎng)作用及其在動物營養(yǎng)中的應用
　　木聚糖在植物細胞壁中的含量僅次于纖維素，是半纖維素中含量最豐富的一種，約占細胞干重的35%[3],是谷物籽實中的主要非淀粉多糖(NSP)之一，它的存在使谷物中的營養(yǎng)物質不能被充分暴露于動物消化液的表面，進而影響動物的消化吸收，降低了飼料的營養(yǎng)價值。木聚糖酶類是專一降解木聚糖的一類，它在生物轉化、食品、飼料、醫(yī)藥、能源、造紙、紡織等行業(yè)中有著廣泛的應用[4]，具有很大的商業(yè)開發(fā)價值。它可以破壞植物細胞壁結構，提高內源性消化酶的活性，提高飼料養(yǎng)分的利用率;降解可溶性多糖，降低其粘性;減少胃腸道疾病，增進動物健康;減少粘糞和臟蛋，降低空氣中有害氣體濃度，減少環(huán)境污染[5]。飼料工業(yè)中添加木聚糖酶可以為畜禽生產帶來良好的生產效果和經濟效益。許多試驗表明，添加木聚糖酶可以提高畜禽的生產性能[6-8]。但也有效果不明顯甚至沒有效果的報道。這些資料顯示生產成績與日糧類型和動物生理條件等因素間存在相關性[9，10]。
　　2 木聚糖酶的結構特點和生化特性
　　對不同來源的木聚糖酶的研究已證實了木聚糖酶的多樣性[11]。木聚糖的完全降解需要木聚糖水解酶系中各種酶相互協(xié)同完成,其中內切木聚糖酶是最關鍵的水解酶。以氨基酸序列相似性和疏水簇分析法為基礎，Henrissat和Bairoch(1993,1996)[12]將糖基糖苷鍵水解酶中的內切木聚糖酶分為10族和11族，這相當于Gilkes(1991)[13]等分類的第F家族和第G家族，它們分別組成高分子量和低分子量的木聚糖酶。10族內切木聚糖酶主要包括酸性和大分子的內切木聚糖酶，而堿性的和小分子的內切木聚糖酶則屬于11族。在結構上木聚糖酶有催化結構域、底物結合結構域、熱穩(wěn)定結構域、Cellulosome-Docking結構域、連接區(qū)域、重復序列和其它未知功能的非催化結構域以及催化結構域[14]，不同的木聚糖酶含有其中的一個或一個以上的區(qū)域。
　　細菌和真菌的β-1，4-木聚糖酶多數為單亞基蛋白，對于不同生物來源的木聚糖酶，分子量(Mr)范圍為8~145kD，pH范圍為3~10.5，穩(wěn)定pH范圍為3~10，多數酶的最適pH范圍為4~7，最適溫度為40~60℃。根據酶的理化特性，可分為兩大類，即Mr小于30kD的酶和Mr大于30kD的酶。70%的酸性β-1,4-內切木聚糖酶Mr在30kD以上，而堿性β-1,4-內切木聚糖酶Mr則多在30kD以下。通常細菌可產生兩種木聚糖酶，即低Mr的堿性木聚糖酶和高Mr的酸性木聚糖酶，但真菌通常只產生低Mr的堿性木聚糖酶[15]。
　　3 飼料木聚糖酶的開發(fā)途徑
　　木聚糖酶要廣泛經濟高效的應用于飼料工業(yè)應具備一定條件。眾所周知，豬胃中的pH一般為2~3.5，十二指腸、空腸和回腸的pH范圍分別為4~6、5.5~6.7和7.0~7.5[16]，因此要求飼用木聚糖酶在pH較廣的范圍內能保持較高的活性。另一方面，現(xiàn)在顆粒料制粒過程中有一個短暫的高溫過程，溫度在75~93℃，多數木聚糖酶在此高溫下會大幅度地喪失活性[17];同時，飼料中的木聚糖酶最終的作用場所是豬正常體溫(37℃)的胃腸中，因此能耐制粒高溫，且在動物正常體溫下具有較高活性成為木聚糖酶在生產中應用的關鍵。
　　目前，在飼料工業(yè)中使用的酶制劑基本上是由微生物發(fā)酵生產的，發(fā)酵結束后獲得的含酶發(fā)酵液需要經過一系列后處理操作，分離菌體，加工成干物質，或者加入各種穩(wěn)定劑才能應用在飼料生產中。在飼用酶的應用中，穩(wěn)定性是影響應用效果的重要因素。目前已經可以通過改進生產工藝如加鹽、制備包被型含酶顆粒等使木聚糖酶的穩(wěn)定性得以提高[18-21]，但是主要的技術指標——發(fā)酵酶活在很大程度取決于產酶菌種的性能和酶本身，目前普遍采用的包被等技術不能從根本上提高酶的熱穩(wěn)定性，而基因工程和蛋白質工程的發(fā)展為改造木聚糖酶特性提供了新手段。
　　3.1 木聚糖酶基因克隆與表達的研究概況
　　到目前為止，已有近百種不同菌株的木聚糖酶基因被克隆或表達出來，其中細菌來源的木聚糖酶克隆較多，但真菌來源的木聚糖酶克隆很少。這些研究多采用大腸桿菌為宿主菌[22]，也有以酵母、木霉、曲霉等真核生物為受體細胞的[17]，而所運用的載體及限制酶則形式多樣?？寺〉哪揪厶敲富蛞话闶褂米陨硭鶖y帶的啟動子在受體菌中表達，但是酶的表達水平比在原始菌株中下降了許多，原來能分泌到細胞外的酶也只有少數在新的受體中能繼續(xù)維持分泌性能。由于克隆的木聚糖酶基因表達水平比在原始菌株中低，從有利于生產及進一步提高表達水平的角度出發(fā)，許多科學家嘗試利用分泌性的芽孢桿菌、鏈霉菌、曲霉等作為生物反應器[23]，并使用具有高效表達啟動子的載體構建新型高效表達基因工程菌，不僅提高了酶活性，而且有些木聚糖酶能分泌到胞外[24]。一般采用CaCl2處理法或電穿孔法將重組質粒轉化到受體細胞，用RBB木聚糖(Remazol Brilliant Blue-Xylan)平板進行篩選，也有利用與可可堿酸鈉偶聯(lián)的木聚糖(AZCL-Xylan)為底物進行檢測的，還有的用剛果紅染色進行篩選。
　　3.2 蛋白質工程改造木聚糖酶
　　蛋白質工程是在重組DNA方法用于“操縱”蛋白質結構之后發(fā)展起來的一個分子生物學分支，它通過修飾蛋白質的基因或改變結構來獲得具有新特性的蛋白質[25]。人們試圖利用已有的結構生物學信息對蛋白質進行合理設計(rational design)，在蛋白質空間結構和功能研究的基礎上，設計一個新的具有人們所期待性質的蛋白質氨基酸序列，然后通過對編碼該蛋白質的基因進行定位突變或盒式突變，再用遺傳工程的方法產生出預期的新的蛋白質。但蛋白質結構的復雜性極大地增加了難度，況且多數要改造的蛋白質我們并不清楚其結構，不能進行合理設計。而隨著分子遺傳學的發(fā)展，作為非合理設計(irrational design)的分子定向進化策略可沖破這一局限性[26]，可以在未知目標蛋白三維結構信息和作用機制的情況下，在體外模擬自然進化的過程(隨機突變、重組和選擇)。通過對編碼基因的隨機突變、重組和定向篩選，獲得具有改進功能或全新功能的蛋白質，使幾百萬年的自然進化過程在短期內得以實現(xiàn)，在蛋白質結構改造中具有極大的潛力。
　　3.2.1 定點突變技術
　　定點突變技術是利用合成的寡核苷酸作誘變物，根據設計的方案，在已知的核苷酸序列中準確地改變蛋白質氨基酸編碼中一個或數個堿基，改變組成蛋白質的一個或數個氨基酸殘基，以研究蛋白質的結構與功能的關系。
　　人們從嗜熱性微生物如細菌、真菌和放線菌中發(fā)現(xiàn)了許多木聚糖酶，它們具有很高的熱穩(wěn)定性，且其催化結構域有較大同源性。以催化結構域的保守殘基分析為基礎進行定點突變改變木聚糖酶性質，如酶活性，熱穩(wěn)定性，pH值穩(wěn)定性等，這些酶在工業(yè)生產上的應用具有十分重要的意義。Georis等[27]建立了木聚糖酶xyl1和TfxA的分子模型，這兩種木聚糖酶分別來自于中溫菌Streptomyces sp.S38和嗜熱菌Termomonospora fusca，都屬于第11家族的木聚糖酶。比較了這2種木聚糖酶的三維結構，并將TfxA酶中的嗜熱結構用定點突變法引入xyl1酶中，以提高其最適反應溫度和熱穩(wěn)定性。將xyl1的11位的蘇氨酸殘基突變?yōu)槔野彼?T11Y)，從而在第11位酪氨酸和第16位酪氨酸之間(Y11-Y16)建立一個和TfxA酶一樣的新的芳香族氨基酸相互作用，結果突變酶的最適溫度由原來的60℃提高到70℃，57℃時酶的熱穩(wěn)定性比原來提高了6倍。進一步對突變的酶分子xyl1進行結構分析發(fā)現(xiàn)，Y11和Y16分別位于β鏈的β1和β2上。它們之間的相互作用增加了xyl1分子氨基末端的穩(wěn)定性。Roberge等[28]用定點突變法研究Streptomyces lividans木聚糖酶A的His86殘基對酶熱穩(wěn)定性的影響，用定點突變法將His86分別突變成6種其它的氨基酸殘基，所有這些突變都使酶的熱穩(wěn)定性大大降低?？梢?，His86是木聚糖酶A耐熱必需的氨基酸。Tumnen等[29]報道將Trichoderma reesei的木聚糖酶II的一個α-螺旋的162位谷氨酰胺突變?yōu)榻M氨酸或酪氨酸后半衰期提高到63min。他們還研究了該酶的活性中心表面增加精氨酸殘基后對酶活和酶的穩(wěn)定性的影響[30]，將5個精氨酸殘基引入到“Ser/Thr表面”(Ser/Thr surface)中，結果Ser/Thr表面的精氨酸使酶在較高的溫度下的活性提高了，在有底物的情況下，木聚糖酶在60~65℃時的熱穩(wěn)定性提高了4~5倍。原因可能是精氨酸的引入使得離子鍵的數目增加，從而增加了酶的pH和熱穩(wěn)定性。Moreau等(1999)[31]用定點誘變技術將Streptomyces lividans 1326的木聚糖酶XYLA中的Arg156變成Glu，結果R156E的特異性酶活性提高了10%至25%，最適溫度比野生型提高了5℃，半衰期提高了6min，提高幅度為47%，而突變酶酶反應的pH性質與天然酶相同。
　　3.2.2 引入二硫鍵
　　研究發(fā)現(xiàn)，在酶蛋白中引入半胱氨酸，從而增加酶蛋白中二硫鍵的數量可以增加某些酶的穩(wěn)定性，但不影響酶的活性。Tumnen等[33]報道將Trichoderma reesei的木聚糖酶II的一個α-螺旋中的110位絲氨酸和154位的天冬氨酸分別突變?yōu)榘腚装彼?，從而?10位和154位建立一個二硫鍵， 65℃時的半衰期從不到1min增加到14min。1994年，Wakarchuk等[34]在木聚糖酶分子中引入不影響其活性的二硫鍵，使其耐熱性提高了15℃。
　　3.2.3 蛋白質體外定向進化
　　蛋白質(或酶)的體外定向進化(directed evolution of protein or enzyme in vitro)，又稱分子進化(molecular evolution)，就是人為地創(chuàng)造特殊的進化條件，模擬自然進化機制(隨機突變、重組和自然選擇)，在體外對蛋白質(或酶)基因進行隨機誘變，用一定的篩選或選擇方法定向選出所需性質的突變酶。目前已發(fā)展出多種定向進化的策略，如易錯PCR(erro-prone PCR)、DNA重排(DNA shuffing)、體外隨機引發(fā)重組(random-priming in vitro recombination,PRP)、交錯延伸(stagger extension process，StEP)等[35，36]。其中DNA改組技術，又稱有性PCR(sexal PCR)，在蛋白質的體外定向進化中起著重要的作用，它不僅可以加速積累有益突變，而且可以使酶的兩個或更多的已優(yōu)化性質合為一體[37]。
　　4 前景與展望
　　綜上所述，木聚糖酶具有廣泛的工業(yè)應用價值，開發(fā)木聚糖酶可以緩解我國飼料資源的不足，變廢為寶，提高飼料的可消化性和動物的生產性能。隨著技術的不斷發(fā)展，可以通過改進生產工藝，利用基因工程、蛋白質工程等生物技術手段，來高效地生產高酶活、適應性、抗逆性強的木聚糖酶，以實現(xiàn)其低成本、產業(yè)化的商品生產。而對木聚糖酶在各種動物不同時期飼喂不同日糧時作用模式的研究，酶的最佳用量和最佳活力環(huán)境的確定、酶活性測定方法的統(tǒng)一以及我國飼料中木聚糖含量數據庫的建立都是我們以后還需努力的方向[3]?？傊?，木聚糖酶必將在未來的畜牧業(yè)發(fā)展中，發(fā)揮出其所具有的巨大潛力和作用。(鐘 茂 謝和芳)

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youzaitianya

質量懸殊太大  酶制劑市場目前很混亂 尤其飼用酶  沒有標準

youzaitianya 于 2010-10-5 22:37 補充以下內容

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