關于飼用酶制劑活性測定影響因素的分析

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　　關于飼用酶制劑活性測定影響因素的分析
　　摘 要：隨著飼用酶制劑的廣泛應用，酶活的測定在飼用酶制劑產品的質量檢驗、產品標簽和酶活保證方面變的必不可少。本文就影響飼用酶制劑活性測定的溫度、PH、作用時間、底物四大要素及非定義要素酶液稀釋度、標準曲線、顯色劑、緩沖液進行了總結分析，以便為廣大酶制劑工作者正確的應用酶制劑提供參考。
　　關鍵詞：酶制劑;酶活;測定;影響因素
　　飼用酶制劑是工業(yè)酶制劑的一個方面，飼用酶的使用已經有50多年的歷史，但飼用酶制劑的快速發(fā)展期卻只是在最近的10～15年時間。近年來，隨著生物技術的發(fā)展，酶制劑的生產成本的日漸下降，越來越多的酶制劑被應用在飼料工業(yè)中，發(fā)展到當前已經形成了龐大的飼用酶制劑市場，其中常用的飼料酶制劑主要有植酸酶、淀粉酶、蛋白酶和非淀粉多糖酶四大類。而隨著酶制劑生產發(fā)展的需要，酶制劑的檢測顯的越來越重要。經過科研工作者多年的艱苦努力，我國飼料工業(yè)標準中已經確立了植酸酶、纖維素酶、β—葡聚糖酶的測定方法。另外，許多企事業(yè)單位為了生產研究的需要也制定了很多用于各種酶制劑活力的測定方法。
　　但是以化學方法檢測酶制劑的活性時存在許多變異因素，這些因素對不同酶制劑的影響不是平行和同步的，我們需要對酶制劑活性的檢測方法和檢測過程有一個正確的理解。因此，本文就飼用酶制劑活性測定影響因素進行了總結分析，以便為廣大酶制劑工作者正確的應用酶制劑提供參考。
　　1 影響飼用酶制劑活性測定的四大要素分析
　　所謂的酶活性都是指在特定的系統(tǒng)和條件下測到的反應速度。為了確保酶制劑測定結果的一致性，飼用酶制劑活性單位定義中對影響酶活大小的主要條件進行了規(guī)定，其中包括溫度、pH值、時間和底物，這些都是酶活力測定系統(tǒng)中最重要的因素，對酶促反應速度影響很大。
　　1.1 溫度對酶活測定的影響
　　酶制劑對溫度非常敏感，在檢測過程中對溫度的控制則顯得非常重要。溫度對酶活性影響主要表現在兩個方面，一方面是當溫度升高時，酶與底物的反應速率加快;另一方面由于隨著溫度的升高將使酶的穩(wěn)定性下降，部分酶蛋白分子逐漸變性而失去活性，引起酶反應速率下降;溫度的這兩種影響的綜合作用而產生酶反應的“最適溫度”。對于不同的酶制劑在不同的情況下最適溫度是有一定的差別。研究木聚糖酶時發(fā)現，在30～40℃條件下酶活較穩(wěn)定，50℃后隨著溫度的升高，酶活力開始下降，90℃時基本失活(李衛(wèi)芬等，1999)。研究纖維素酶最適酶解條件時發(fā)現，在36～58℃之間纖維素酶相對酶活隨著溫度升高而升高，當溫度在58～62℃之間時，相對酶活性沒有明顯變化，曲線近似呈水平狀態(tài)，在40℃、45℃、50℃條件下，其相對酶活分別為56%、70%、80%，而當溫度大于58℃以上時相對酶活不再升高(王琳等，1998)。同時，酶在不同條件下適宜溫度也可能要受到酶的純度、底物、激活劑、抑制劑以及酶促反應時間等因素的影響。
　　1.2 pH對酶活測定的影響
　　pH值在酶活測定時對測定結果影響很大，各種酶制劑在一定條件下都有其特定的最適酶解pH，酶的最適pH會隨著底物種類和濃度、緩沖液種類和濃度的不同而改變，因此最適pH也只有在一定條件下才有意義。pH影響酶活力的原因可能有以下幾個方面：1、過酸或過堿可以使酶的空間結構破壞，引起酶構象的改變，也影響酶活性部位催化基團和結合基團的解離狀態(tài)，酶活性喪失;2、當pH改變不是很劇烈時，酶雖未變性，但酶活受到了影響。pH影響了底物的解離狀態(tài)，或者使底物不能和酶結合，或者結合后不能生成產物。pH影響酶分子活性部位上有關基團的解離，從而影響與底物的結合或催化，使酶活性降低可能影響到中間絡合的解離狀態(tài)，不利于酶解生成產物;3、pH影響維持酶分子空間結構的有關基團解離，從而影響了酶活性部位的構象，進而影響酶的活性;4、pH影響底物的帶電狀態(tài)。這些都直接影響酶和底物的親和力，影響酶解反應速度(王靜，2003;李險峰，2000)。文獻報道，很多酶的最適酶解pH都在3.0～6.0之間(NAKAMURA, T. 1997)。研究不同pH值對嗜熱毛殼菌木聚糖酶活性的影響發(fā)現，在pH值3.6以前，隨著pH值的增大，木聚糖酶的活性逐漸升高;pH值為3.6時，木聚糖酶的活性最高，且在3.2~4.4范圍內木聚糖酶的活性維持較高濃度，維持嗜熱毛殼菌木聚糖酶活性的適宜的pH值范圍應為3.2~4.4(王愛娜等，2006)。楊會濤等(2006)研究pH對木聚糖酶活性影響的結果表明，該酶的最適反應pH為6.0。洪楓等(2000)在研究木聚糖酶最適pH值時指出，里氏木霉RutC-30合成的木聚糖酶最適pH值范圍在4.0～5.0之間，pH值對木聚糖酶的酶活影響很大。
　　1.3 作用時間對酶活測定的影響
　　酶催化反應的動力學表明，酶解是一個有一定時間差的過程，當酶解產物達到一定濃度后會對酶產生反饋抑制作用，因而反應速度隨著時間延長會越來越慢，所以酶解并非酶解時間是越長越好。測定木聚糖酶酶促反應開始至30 min內的產物生成量，結果表明13 min內產物的吸光度隨反應時間幾乎呈線性增長，其斜率可以代表酶促反應的初速度，此后速度減慢(單位時間內產生的還原糖量呈下降趨勢)，相對酶活逐漸降低(費笛波等，2004)。用DNS法測定纖維素酶活時反應1min后，酶作用底物產生的還原糖量隨時間延長呈直線上升，5min后還原糖量的增加變得比較緩慢，10min后，曲線呈現水平狀態(tài)，還原糖量不再增加，往后隨著時間的延長相對酶活逐漸降低(王琳等，1998)。
　　1.4 底物對酶活測定的影響
　　底物的選擇對酶活的測定影響也很大。米氏方程表達了酶反應速度與底物濃度之間的定量關系，其反應方程式可表示為：E+S←→ES→P+E，首先酶(E)和底物(S)作用形成中間產物(ES)，然后形成產物(P)并釋放出酶(E)。在此平衡反應中，底物(S)的濃度將影響反應速度。當底物濃度較低時，底物濃度與酶活性成正比關系;當底物濃度增加到一定濃度時，酶活將趨于一個極限值，這時酶已被底物所飽和，所以在測定酶活時，底物濃度應大于這個極限值，這樣酶活性直接正比于酶濃度而與底物濃度無關，否則會極大地影響測定結果。研究底物濃度對木聚糖酶活性測定的影響結果表明：底物濃度對測定結果有較大影響，底物濃度越高，測定結果也越高;底物濃度在0.006～0.032g/ml時，酶活性的升高與底物濃度呈顯著正相關;當底物濃度升高到0.032g/ml以上時，酶活性隨底物濃度的升高幅度趨緩(聶國興等，2002)。研究底物對纖維素酶活性測定影響的結果表明，以Sigma產C5678為底物，纖維素酶活性測定值明顯高于上海產的羧甲基纖維素鈉測定值，且C5678濃度大于3%后，其濃度對纖維素酶活性測定值無明顯影響(顧賽紅等，2006)。
　　2 影響飼用酶制劑活性測定的非定義要素分析
　　在進行酶制劑的檢測過程中，除了以上分析的幾點酶活定義中規(guī)定影響飼用酶制劑測定結果的因素外，酶活測定方法中還存在許多對酶活測定結果影響很大的非定義因素，這其中包括樣品酶的稀釋度、標準曲線的制作、顯色劑的配置、緩沖液的離子強度等。
　　2.1 酶液稀釋度對酶活測定的影響
　　測定酶樣時進行稀釋可能帶來兩種效應，一是影響酶的穩(wěn)定性，二是降低樣品中原有抑制因素和輔助因素的濃度。目前測定酶活的方法通常是先把酶稀釋，然后測定稀釋酶的活力，所得到的結果乘以稀釋倍數即為原酶的活力。但是，事實上許多酶的活力和稀釋倍數并不成比例關系。據陸文清、李德發(fā)分析(2002)，選擇酶樣的稀釋倍數實質上是選擇酶分子與底物分子之間的數量比例，二者的比例只有在適當的范圍內時酶蛋白的活力才與產物的生成量呈線性正比例關系。酶樣稀釋倍數過大會影響酶活的穩(wěn)定性，稀釋倍數不同最終獲得的酶活測定值有很大差異(顧賽紅等，2006)。費笛波等(2004)為探討稀釋率對木聚糖酶測定結果的影響，將酶樣稀釋度從1000倍升至11000倍，結果表明，稀釋度的改變，明顯影響酶活力測定結果，稀釋度低，因吸光值太大使結果大大偏低;但稀釋度過大因A值過小，結果也偏低。因此，測定時應規(guī)定合理的吸光值范圍(以0.2～0.5為宜)，以獲得相對穩(wěn)定的測定結果。
　　2.2 標準曲線對酶活測定的影響
　　標準曲線是酶制劑檢測過程中能求出檢測值的唯一對照依據，曲線方程的大小直接影響著換算出來的測定值。為了減少系統(tǒng)誤差給測定帶來的影響，標準曲線制作時應盡可能和樣品在同一條件下反應。標準曲線的制作一般可以采用相對法和絕對法兩種形式，相對法是借助已知準確含量的酶標準對照品作標準曲線，絕對法則是用一些酶活定義中規(guī)定的反應產物來衡量酶解產物作標準曲線。相對于絕對法，相對法測定結果精度高，速度快，費用低。分析來自不同實驗室的測定結果表明，兩種方法的精確度有近3倍的差異(張若寒，2001)。絕對法適用于法定的質量認證及仲裁機構，為一般單位常規(guī)測定提供基準物質，相對法適用于一般有日常測定需要的機構或企業(yè)。
　　2.3 顯色劑的配置對酶活測定的影響
　　在酶制劑檢測反應的最后都要對反應產物進行顯色，并用不同的方式對比產物生成的量，一般應用分光光度計法較多，也有用滴定法等其它方法。其中，顯色劑類型的不同、相同顯色劑但其中物質配比的不同、顯色劑在反應中添加量的不同以及顯色時間的不同，都會產生不同的反應結果，對酶活檢測的值也會產生一定的影響。植酸酶酶活測定的機理都是利用酶水解植酸鈉底物形成無機磷，然后測定無機磷的釋放量，采用四種顯色方法對比測定植酸酶反應產生的無機磷，分別是：丙酮—磷鉬酸銨法、釩—鉬酸銨法、維生素C —鉬藍法、鉬藍法，對比結果表明，丙酮—磷鉬酸銨法較其他三種方法更具有優(yōu)勢(黃遵錫等，1999)。聶國興(2002)研究了DNS量對木聚糖酶活性測定的影響，結果表明：由于DNS用量變化，測定結果也發(fā)生了明顯變化，DNS用量在3ml時測得的酶活最高。王琳等(1998)研究DNS法測定纖維素酶活力最適條件，結果表明DNS顯色5分鐘比較適宜。
　　2.4 緩沖液的離子強度對酶活測定的影響
　　反應體系中緩沖液的離子強度影響酶制劑的蛋白空間結構，從而影響其催化能力。所以，測定酶活時應盡可能統(tǒng)一反應緩沖液的種類和離子強度。研究植酸酶測定所用緩沖液時發(fā)現，使用檸檬酸緩沖液測定商業(yè)植酸酶(真菌植酸酶和細菌植酸酶)的酶活僅相對于使用乙酸緩沖液的65～70%(Nelson E. Ward等，2007)。Dalsgaard等(2007)發(fā)現，用檸檬酸緩沖液檢測兩種大腸桿菌植酸酶的酶活只相當于用乙酸緩沖液得到的酶活的三分之一。
　　3 結 語
　　酶活的測定在飼用酶制劑產品的質量檢驗、產品標簽和酶活保證方面是必不可少的。酶活測定是一種非常細致的工作，以上分析了一些影響酶制劑檢測的主要影響因素，但在酶制劑檢測的過程中，有些細節(jié)問題對酶制劑檢測也會產生一定的影響，比如：一些操作細節(jié)、離心速度、搖勻力度和次數、攪拌時間、移液器的正確使用以及玻璃儀器的清潔度等。這些細節(jié)可能不是酶制劑研究工作者非常關注和研究的焦點，但對一些性質不穩(wěn)定的酶制劑進行檢測時，這些細節(jié)問題的疏忽也會對結果產生較大的影響。所以，在飼用酶制劑酶活檢測過程中，我們不但要理解影響酶制劑酶活測定的主要因素，正確把握各影響因素的關鍵點，對于一些其它的細小影響因素也不能掉以輕心，盡量把酶制劑檢測過程中每一個要點和步驟做好。

lilyyang

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