體外產(chǎn)氣技術(shù)的發(fā)展及應(yīng)用

apple12151007 · 發(fā)表于 2010-10-20 10:49:57

　　體外產(chǎn)氣技術(shù)的發(fā)展及應(yīng)用

　　史良1 2 刁其玉2

　　(1 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物所北京 2 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料所北京)

　　【摘要】體外產(chǎn)氣技術(shù)是利用體外方法評(píng)定反芻動(dòng)物飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的方法與技術(shù)。本文針對(duì)體外產(chǎn)氣法的原理、特點(diǎn)及應(yīng)用進(jìn)行了評(píng)述.

　　【關(guān)鍵詞】體外產(chǎn)氣法，產(chǎn)氣量，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，反芻動(dòng)物

　　The Development and Application of in Vitro Gas Production Technique

　　SHI Liang1 2 DiaoQiYu2

　　(1 Chinese Academy of Medicial Science Institute of Laboratory Animal Science

　　2 Chinese Academy of Agricutural Science Feed Research Institute)

　　【Abstract】In vitro gas production techniques are widely used for assessment of nutritional quality of ruminant feeds.The theory , advantageand and application of this techniques were reviewed。

　　【Key words】 in vitro gas production;gas;nutritional value;ruminants

　　粗飼料的采食量和消化率會(huì)極大影響反芻動(dòng)物的生產(chǎn)性能，但通過(guò)體內(nèi)法測(cè)定飼料的采食量和消化率費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、價(jià)格昂貴、需要大量的飼料品而且不能大量地測(cè)定，所以，科學(xué)家一直在嘗試通過(guò)實(shí)驗(yàn)室方法來(lái)測(cè)定采食量和消化率。

　　1 體外技術(shù)的發(fā)展

　　二十世紀(jì)五十年代以來(lái)建立的體外法，包括英國(guó)學(xué)者Tilly-Terry(1963年)建立的兩階段法，Raab L.等(1983年)、德國(guó)荷恩海姆大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所Menke K.H.(1979)等人發(fā)展的產(chǎn)氣法(The gas production method)、真菌纖維素酶法和尼龍袋法。

　　瘤胃降解與氣體產(chǎn)量之間的關(guān)系很早就被關(guān)注，但直到上世紀(jì)40年代才開(kāi)始測(cè)定瘤胃的氣體產(chǎn)量(Quin，1943)。Menke等(1979)通過(guò)體外產(chǎn)氣的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)體外產(chǎn)氣量與體內(nèi)的消化參數(shù)具有很高的相關(guān)性。在此之后，產(chǎn)氣技術(shù)才被確定為評(píng)價(jià)飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的有效方法之一。

　　2 體外產(chǎn)氣技術(shù)的原理

　　2.1 體外產(chǎn)氣技術(shù)的原理

　　當(dāng)體外利用緩沖瘤胃液消化飼料時(shí)，碳水化合物會(huì)降解成短鏈的脂肪酸(SCFA)、氣體(主要是二氧化碳和甲烷)和微生物的細(xì)胞成份。氣體主要是碳水化合物在降解為乙、丙、丁酸的過(guò)程中產(chǎn)生的，與碳水化合物相比，蛋白質(zhì)降解時(shí)的產(chǎn)氣量要低(Wolin，1960)，脂肪的產(chǎn)氣量可以忽略不計(jì)。

　　體外產(chǎn)氣技術(shù)中的氣體成份主要是發(fā)酵產(chǎn)生的二氧化碳、甲烷以及緩沖液緩沖短鏈脂肪所釋放的二氧化碳。當(dāng)利用碳酸鹽緩沖液培養(yǎng)粗飼料時(shí)，約50%的氣體為緩沖液緩沖短脂肪酸時(shí)所產(chǎn)生，其余的則為發(fā)酵產(chǎn)生(Blummel 和Ørskov,1993)，當(dāng)所產(chǎn)生的丙酸比例較高時(shí)(精料)，緩沖液釋放的二氧化碳可達(dá)總產(chǎn)量的60%。利用磷酸鹽緩沖液時(shí)，每1mmol的短鏈脂肪酸能使緩沖液釋放0.8-1 mmol的二氧化碳(Beuvik和Spoelstra，1992;Blummel 和Ørskov,1993) 。

　　2.2 產(chǎn)氣量的理論計(jì)算

　　若體外培養(yǎng)的產(chǎn)物能進(jìn)行測(cè)定，可以通過(guò)這些數(shù)據(jù)計(jì)算體外的產(chǎn)氣量，理想的計(jì)算值與實(shí)際觀測(cè)值之間具有高度的相關(guān)性(Beuvik和Spoelstra,1992)，另外，還可以通過(guò)短鏈脂肪酸的摩爾比以及總量計(jì)算出發(fā)酵時(shí)二氧化碳和甲烷的產(chǎn)量。

　　3 體外產(chǎn)氣技術(shù)的用途

　　3.1 消化參數(shù)的預(yù)測(cè)

　　Menke等(1979)對(duì)體外產(chǎn)氣量和各種化學(xué)成份進(jìn)行多元回歸，建立了飼料體內(nèi)有機(jī)物消化率與這些因素的回歸方程(R=0.98;S.D.=0.25)。其他學(xué)者們(Chenost等，1997)也報(bào)導(dǎo)了體外產(chǎn)氣量與體內(nèi)消化率具有顯著的相關(guān)性，若考慮飼料中蛋白對(duì)產(chǎn)氣量的影響則能進(jìn)一步提高對(duì)體內(nèi)消化率的預(yù)測(cè)。

　　Raab等(1983)在Menke等(1979)的注射器式產(chǎn)氣技術(shù)和氨測(cè)定技術(shù)基礎(chǔ)上，提出了測(cè)定瘤胃蛋白降解率的方法。飼料在缺乏或存在碳水化合物的體外體系中培養(yǎng)，由于產(chǎn)氣量與培養(yǎng)液中氨的濃度是呈負(fù)相關(guān)的，這樣就能夠計(jì)算出在沒(méi)有可發(fā)酵碳水化合物時(shí)氨氮的釋放量，飼料所釋放的凈的氨氮量就可以用總氨氮量減去通過(guò)計(jì)算得到的空白氨氮量(不含底物培養(yǎng)時(shí)的氨氮)而得，這樣就可以計(jì)算出飼料蛋白的體外降解率。

　　3.2 發(fā)酵的動(dòng)力學(xué)研究及產(chǎn)氣的數(shù)學(xué)模型

　　飼料發(fā)酵的動(dòng)力學(xué)參數(shù)可以通過(guò)發(fā)酵產(chǎn)氣量和緩沖液緩沖短鏈脂肪酸所釋放的氣體計(jì)算得到，這些參數(shù)主要與飼料中可溶、不可溶但能降解和不能降解的部分所占的比例有關(guān)，通過(guò)對(duì)產(chǎn)氣特性的數(shù)學(xué)描述可以分析數(shù)據(jù)、評(píng)價(jià)底物和培養(yǎng)液造成的差異和飼料溶解成份及慢速發(fā)酵成份的降解率。研究者們已經(jīng)建立了很多模型來(lái)描述體外產(chǎn)氣。Ørskov和McDonald(1979)基于尼龍袋法所建立的指數(shù)模型已被廣泛的用來(lái)評(píng)價(jià)飼料的降解動(dòng)力學(xué)參數(shù)。該方法也可用作體外產(chǎn)氣法時(shí)的動(dòng)力學(xué)描述(Blumen等，1991;Siaw等，1993)，該模型假定飼料的降解速度是恒定的，即描述的是動(dòng)力學(xué)的第一級(jí)參數(shù)(Groot等，1996)。但由于有一些飼料顆粒的發(fā)酵速度并不一致，所以該模型不能試用所有飼料。Beuvik和Kogut(1993)比較了多種產(chǎn)氣模型，發(fā)現(xiàn)與S型模型相比，指數(shù)模型會(huì)導(dǎo)致比較大的殘余平均方差。Groot等(1996)建立了“三段”模型來(lái)區(qū)分飼料中可溶、不可溶但能降解和不能降解的部分，從理論上來(lái)說(shuō)，該模型能夠提供非常有用的數(shù)據(jù)，但利用該模型時(shí)，需要非常復(fù)雜的設(shè)備來(lái)記錄各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的產(chǎn)氣量。熊本海等(2001)采用Jerson等(1996)多項(xiàng)組合數(shù)學(xué)模型模擬產(chǎn)氣擬合曲線，結(jié)合分析不同培養(yǎng)時(shí)間后的殘余物，可以確定底物降解的動(dòng)力學(xué)特征。

　　3.3 隨意采食量的預(yù)測(cè)

　　隨意采食量是限制反芻動(dòng)物利用粗飼料的一個(gè)重要因素，所以預(yù)測(cè)采食量特別是纖維類物質(zhì)的采食量，是反芻動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)的一個(gè)重要研究領(lǐng)域。眾多學(xué)者均報(bào)道體外產(chǎn)氣量與干物質(zhì)采食量有顯著性的相關(guān)性(Blummel和Becker，1997;Chenost等，1997)，利用體外產(chǎn)氣量可以預(yù)測(cè)動(dòng)物的采食量。與全飼料的產(chǎn)氣量相比，從飼料中提取的中性洗滌纖維的產(chǎn)氣量與隨意采食量的相關(guān)性更高，中性洗滌纖維的產(chǎn)氣量較全飼料的產(chǎn)氣量更能準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)采食量(82%vs75%)(Blummel和Becker，1997)。

　　3.4 抗?fàn)I養(yǎng)因子的研究

　　產(chǎn)氣技術(shù)可能還比化學(xué)分析法更能準(zhǔn)確地定量飼料中的抗?fàn)I養(yǎng)因子?；瘜W(xué)方法只是根據(jù)某一個(gè)抗?fàn)I養(yǎng)因子的理化特性來(lái)測(cè)定其含量，但抗?fàn)I養(yǎng)因子在動(dòng)物體內(nèi)表現(xiàn)的是其生物學(xué)上的特性，而且同一個(gè)抗?fàn)I養(yǎng)因子在不同的飼料中可能會(huì)再現(xiàn)出不同的特性，而體外產(chǎn)氣技術(shù)則是綜合地體現(xiàn)出營(yíng)養(yǎng)因子在生物層面上對(duì)發(fā)酵的影響。Makkar等(1995)利用體外產(chǎn)氣技術(shù)研究了單寧和茶皂素的作用，并測(cè)定了它們對(duì)微生物蛋白合成的影響，發(fā)現(xiàn)單寧和茶皂素的作用是累加的，相互不會(huì)抵消對(duì)方的作用。飼料中的酚類物質(zhì)對(duì)消化有負(fù)面作用，而且通過(guò)體外產(chǎn)氣技術(shù)得到的影響比尼龍袋法得到的更為顯著(Khazaal等，1993)。

　　Makkar和Becker(1995)利用單寧的生物學(xué)特性，在體外培養(yǎng)時(shí)加入聚乙烯乙二醇6000(PEG6000)來(lái)研究單寧的活性，該配體能與單寧結(jié)合為PEG-單寧從而使產(chǎn)氣量升高，單寧對(duì)瘤胃微生物的影響越大，產(chǎn)氣量的升高幅度就越大。然后根據(jù)產(chǎn)氣量和Menke(1979)建立的公式計(jì)算出代謝能和有機(jī)物的消化率，從而評(píng)價(jià)含有單寧的飼料中單寧對(duì)飼料代謝能和有機(jī)物消化率可能的影響。

　　3.5 評(píng)價(jià)飼料間組合效應(yīng)

　　在配制反芻動(dòng)物日糧時(shí),我們假設(shè)配合日糧中總的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等于單個(gè)飼料組分的加權(quán)和值。然而有時(shí)配合日糧的表觀消化率并不等于日糧中各單個(gè)飼料組分表觀消化率的加權(quán)和值。

　　Sampath等(1995)利用體外產(chǎn)氣技術(shù)測(cè)定了基礎(chǔ)日糧與補(bǔ)充料混合物的產(chǎn)氣量，從而研究基礎(chǔ)日糧與補(bǔ)充料之間的組合效應(yīng)，該試驗(yàn)顯示，易發(fā)酵的飼料補(bǔ)充料能提高瘤胃微生物的活性，從而促進(jìn)粗飼料的降解?；ㄉ炁c稻草之間存在正組合效應(yīng)，而與稻糠之間則出現(xiàn)負(fù)組合效應(yīng)。他們還發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)的早期(12h)的組合效應(yīng)比培養(yǎng)末期(52h和166h)要強(qiáng)得多。蘇海涯(2001)利用體外產(chǎn)氣技術(shù)研究了桑葉與各種餅粕類飼料間的組合效應(yīng)，并從能氮平衡上解釋了組合效應(yīng)產(chǎn)生的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)用產(chǎn)氣量評(píng)定的結(jié)果同用消化率評(píng)定的結(jié)果在趨勢(shì)上高度一致，他認(rèn)為可以以直接用氣體產(chǎn)量評(píng)定飼料間的組合效應(yīng)。Liu等(2002)采用體外產(chǎn)氣法研究了未處理稻稈和化學(xué)處理稻稈中添加黑麥草和桑樹(shù)葉時(shí)也發(fā)現(xiàn)了正組合效應(yīng)。他們認(rèn)為這是由于添加的牧草或蛋白質(zhì)類飼料(如花生餅、棉餅)增加了組合料中的易發(fā)酵物質(zhì)(如能量、氨基酸或縮氨酸),從而促進(jìn)了瘤胃微生物的生長(zhǎng),使組合料在體外培養(yǎng)時(shí)產(chǎn)生了組合效應(yīng)。

　　使用這種方法，Sandoval-Castro等(2002)研究?jī)煞N粗飼料(L.leucocephala和L.latisiliquum)與精料或干草之間的組合效應(yīng)，以總產(chǎn)氣量為衡量發(fā)現(xiàn)粗飼料與精料間存在組合效應(yīng)而與干草之間卻不出現(xiàn)組合效應(yīng)。Getachew等(2003)研究了玉米青貯、大麥、豆粕和苜蓿干草之間的組合效應(yīng)。發(fā)現(xiàn)超過(guò)10%的正組合效應(yīng)發(fā)生在體外培養(yǎng)的早期階段(例如6h)，但是，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，這些效應(yīng)則逐漸消失。同時(shí)，使用三種原料的混合在6h時(shí)組合效應(yīng)值為7%-11%，而到了24h時(shí)，下降到3%-4%，在72h時(shí)則為1%-2%。

　　在體外產(chǎn)氣法中，組合效應(yīng)發(fā)生的程度隨著飼料的種類和不同比例而變化，特別是隨著培養(yǎng)時(shí)間而變化，因此，在某些情況下應(yīng)用體內(nèi)法來(lái)驗(yàn)證體外法的結(jié)果是必需的。

　　3.7 甲烷的測(cè)定

　　甲烷是導(dǎo)致溫室效應(yīng)的主要因素之一。反芻動(dòng)物是主要的甲烷排放源，同時(shí)甲烷是瘤胃發(fā)酵能量損失的主要原因，約有6%-15%的飼料能量以甲烷的形式被損耗，因此對(duì)瘤胃甲烷產(chǎn)量調(diào)控、測(cè)定甲烷含量是必要的。使用體外技術(shù)被認(rèn)為是比較可行的測(cè)定甲烷含量的有效方法(Soliva等，2003;Mohammed等，2004)。

　　Getachew等(2005)利用體外產(chǎn)氣法評(píng)價(jià)7種TMR日糧的總產(chǎn)氣量和甲烷產(chǎn)量。結(jié)果表明，甲烷含量在6和24h時(shí)沒(méi)有差異，但在48和72h則有差異。Lee等(2003)應(yīng)用產(chǎn)氣法測(cè)定了24h甲烷產(chǎn)量。谷物的甲烷產(chǎn)量范圍為34-58ml/gDM，而粗飼料的甲烷含量范圍在12-30ml/gDM變化。許多應(yīng)用產(chǎn)氣法測(cè)定甲烷產(chǎn)量與體內(nèi)法測(cè)定的結(jié)果是相似的(Moss等，2002)，表明這種方法在測(cè)定甲烷產(chǎn)量變化是可行的。

　　4結(jié)語(yǔ)

　　體外產(chǎn)氣法是評(píng)定反芻動(dòng)物飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的一種非常有效的方法，一次可進(jìn)行大量樣本的測(cè)定，與體內(nèi)法相比，不需要大量的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，并且結(jié)果與體內(nèi)法具有高度相關(guān)性，已經(jīng)越來(lái)越多的應(yīng)用在反芻動(dòng)物飼料營(yíng)養(yǎng)研究上。

　　參考文獻(xiàn)

　　1. 蘇海涯，吳躍明，劉建新.反芻動(dòng)物飼料間的組合效應(yīng)，飼料博覽，2001 8: 18-19

　　2. 熊本海，盧德勛。許冬梅.利用體外法研究飼料的產(chǎn)氣曲線及5種養(yǎng)分的發(fā)酵系數(shù)[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào).2001。32(2)：113-121.

　　3. Beuvink, J.M.W., S.F.Spoelstra, R.J.Hogendorp. 1992. An automated method for measuringtime-coruse of gas production of feedstuff incubated with buffered rumen fluid. 3. Agric. Sci 40: 401-407.

　　4. Beuvink, J.M.W., J. Kogut. 1993. Modeling gas production dinetics of grass silages incubated with buffered ruminal fluid. ;f. Anim. Sci. 71:1041一1046.

　　5. Blummel, M., Becker, K., 1991. The degradability characteristics of 54 roughages and detergent fibrt as described by gas production and their relationship to voluntary feed intake. Br. J. Nutr. 77: 757-768

　　6. Blummel, M. and E:R. Ørskov. 1993. Comparison of in vitro gas production and nylon bag degradability of roughages in predicting feed intade in cattle. Anim. Feed. Sci. Technol. 40: 109-119.

　　7. Blummel, M., H.Steingab, and K.Becker. 1997. The relationship between in vitro gas production, in vitro microbia.lbiomass yield and 15N incorporation and its implications for the prediction of voluntary feed iintake of roughases. Bri. J. Nutr. 77: 911-921

　　8. Chenost, M., Deverre, F., Aufrere, J., Demarquilly, C., 1997. The use of gas-test technique for predicting the feeding value forage plants. In: In vitro techniques for measuring nutrient supply to ruminants. Proceedings of Occasional Meeting of the British Sociey of Animal Science, 8-10 July 1997, University of reading, UK.

　　9. Chenost, M., Deverre, F., Aufrere, J., Demarquilly, C., 1997. The use of gas-test technique for predicting the feeding value forage plants. In: In vitro techniques for measuring nutrient supply to ruminants. Proceedings of Occasional Meeting of the British Sociey of Animal Science, 8-10 July 1997, University of reading, UK

　　10. Groot, J. C. J., J. W. Cone, B. A. Williams, F. M. A. Debersaques, and E. A. Lantinga. 1996. Multiphasic analysis of gas production kinetics for in vitro fermentation of ruminant feeds. Anim. Feed Sci. Technol. 64:77–89

　　11. Getachew, G., Robinson, P.H., Cone, J.W., 2003. Evaluation of associative effects of feeds using in vitro gas production. J. Anim. Sci. 81, 337

　　12. Getachew, G., Robinson, P.H., DePeters, E.J., Taylor, S.J., Gisi, D.D., Higginbotham, G.E., Riordan, T.J., 2005.Methane production from commercial dairy rations estimated using an in vitro gas technique. Anim. Feed Sci.Technol

　　13. Jerson G J，et al Maltiphasic analysis of gas production kinetics for in vitro fermentation of ruminant feeds[J].AnimFeed Sci Technol，1996，64：77-89

　　14. Khazaal, K., Markantonatos, X., Ørskov, E.R., 1993. Changes with maturity in fibre composition and levels of extractable polyphenols in Greek browse: effects on in vitro gas production and in sacco dry matter degradation.J. Sci. Food Agric. 63, 237–244

　　15. Lee, H.J., Lee, S.C., Kim, J.D., Oh, Y.G., Kim, B.K., Kim, C.W., Kim, K.J., 2003. Methane production potential of feed ingredients as measured by in vitro gas test. Asian-Aust. J. Anim. Sci. 16, 1143–1150

　　16. Liu, J. X., A. Susenbeth, and K. -H. Stidekum.2002 In vitro gas production measurements to evaluate interactions between untreated and chemically treated rice straws, grass hay, and mulberry leaves. J. Anim. Sri. 80: 517-524

　　17. Makkar, H.P.S., M.Blummel, K.Becker. 1995. In vitro effects of and interactions between tannins and saponins and fate of tannins in the rumen. J. Sci. Food Agric. 69: 481-493

　　18. Menke，KH,,et al， rhe gas production method[J]J.Ato'ic.Sci.，1979，(93)：217-222.

　　19. Mohammed, N., Lila, Z.A., Ajisaka, N., Hara, K., Mikuni, K., Hara, K., Kanda, S., Itabashi, H., 2004. Inhibition of ruminal microbial methane production by -cyclodextrin iodopropane, malate and their combination in vitro.J. Anim. Physiol. Anim. Nutr. 88, 188–195

　　20. Moss, A.R., 2002. Environmental control of methane production by ruminants. In: Takahashi, J., Young,B.A. (Eds.), Greenhouse Gases and Animal Agriculture. Elsevier, Amsterdam, The Netherlands, pp. 67–76

　　21. Ørskov, E. R., McDonald. 1979. The estimation of protein degradability in the rumen from incubation measurements weighted according to rate of passage. J. Sci. Food Agric. 92: 499-503

　　22. Raab, L., Cafantaris, B., Jilg, L.T., Menke, K.H., 1983. Rumen protein degradation and biosynthesis. 1. A new method for determination of protein degradation in rumen fluid in vitro. Br. J. Nutr. 50, 569–582

　　23. Sampath, K.T., Wood, C.D., Prasad, C.S., 1995. Effect of urea and by-products on the in vitro fermentation of untreated and urea treated finger millet (Eleusine coracana) straw. J. Sci. Food Agric. 67, 323–328

　　24. Sandoval-Castro, C.A., Capetillo-Leal, C., Cetina-Gongora, R., Ramirez-Aviles, L., 2002. A mixture simplex design to study associative effects with an in vitro gas production technique. Anim. Feed Sci. Technol. 101,191–200

　　25. Siaw, D. E. K. A., P. O. Osuji, I. N. Nsahli. 1993. Evaluation of multipurpose tree germplasm: the use of gas production and rumen degradation characteristics. J. Agric. Sci. 120: 319-330

　　26. Soliva, C.R., Hindrichsen, I.K., Meile, L., Kreuzer, M., Machm¨uller, A., 2003. Effects of mixtures of lauric and myristic acid on rumen methanogenesis in vitro. Lett. Appl. Microbiol. 37, 35–39.

　　27. Tilley, J.M.A., Terry, R.A., 1963. A two-stage technique for the digestion of forage crops. J. Br. Grassl. Soc. 18,104–111

　　28. Wolin, M.J. 1960. A theoretical rumen fermentation balance. J. Dairy Sci. 43: 1452-1459