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微量元素氨基酸螯合物的營(yíng)養(yǎng)作用機(jī)理 江南大學(xué)食品學(xué)院/樂(lè)國(guó)偉 摘 要 微量元素是動(dòng)物維持生命和生產(chǎn)必不可少的營(yíng)養(yǎng)素,直接或間接地參與機(jī)體幾乎所有生理和生化過(guò)程,其作用與動(dòng)物生長(zhǎng)和健康密切相關(guān)。微量元素添加劑經(jīng)歷了無(wú)機(jī)鹽類(lèi)添加劑、簡(jiǎn)單的有機(jī)物和氨基酸微量元素螯合物三個(gè)發(fā)展階段。氨基酸與肽的微量元素螯合物作為第三代微量元素添加劑,具有良好的生物穩(wěn)定性、易被消化吸收、生物學(xué)效價(jià)高等特點(diǎn),認(rèn)識(shí)氨基酸與肽的微量元素螯(絡(luò))合物的吸收、代謝途徑及其作用機(jī)制,有助于其廣泛的推廣應(yīng)用。 關(guān)鍵詞 微量元素;氨基酸螯合物;營(yíng)養(yǎng);機(jī)理 1 微量元素氨基酸螯合物化學(xué)性質(zhì) 微量元素氨基酸螯合物對(duì)飼料有效成分破壞作用小。氨基酸微量元素螯合物因其金屬離子與氨基酸分子通過(guò)配位鍵結(jié)合后,使其分子內(nèi)電荷趨于中性,形成了較穩(wěn)定的化學(xué)結(jié)構(gòu)。配位體與金屬離子間的結(jié)合常數(shù),影響穩(wěn)定性與利用能力,適宜的穩(wěn)定常數(shù)決定其在消化吸收以及在靶組織的釋放、利用能力。在體內(nèi)pH環(huán)境下,有效的保護(hù)了螯合物中的金屬離子,既有防止與飼料中植酸、磷酸根離子等的結(jié)合作用,又有阻止動(dòng)物消化道中不溶性膠體的吸附作用,從而提高了動(dòng)物機(jī)體對(duì)金屬離子的吸收。微量元素螯合物中的金屬離子在配位體如氨基酸的保護(hù)下,可有效地抵御與其他離子生成難溶的無(wú)機(jī)鹽,緩解礦物質(zhì)間的拮抗競(jìng)爭(zhēng)作用。而氨基酸、肽的微量元素螯合物具有類(lèi)似二肽的結(jié)構(gòu),消減了氨基酸吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)的競(jìng)爭(zhēng)。配位體的性質(zhì),提供抗氧化性的功能基團(tuán)。同時(shí),在體外減輕了金屬離子氧化還原反應(yīng)對(duì)維生素的破壞,從而減少了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的損失,增強(qiáng)了其吸收利用的程度。微量元素-氨基酸螯合物提高復(fù)合預(yù)混料中維生素的儲(chǔ)存穩(wěn)定性,明顯降低預(yù)混料中維生素?fù)p失率。 2 微量元素氨基酸吸收利用機(jī)制 無(wú)機(jī)鹽微量元素必須借助輔酶的作用與氨基酸或其他物質(zhì)形成絡(luò)合物后才能被機(jī)體吸收[1],吸收后金屬元素在血液中與某些蛋白結(jié)合,被運(yùn)輸?shù)綑C(jī)體所需要的部位發(fā)生功效。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為,有機(jī)微量元素如鋅在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)的吸收代謝與無(wú)機(jī)鹽不同,氨基酸及蛋白螯合物利用肽和氨基酸的吸收機(jī)制,不同于小腸中無(wú)機(jī)鋅的吸收機(jī)制,位于五元或六元環(huán)螯合物中心的金屬可以通過(guò)小腸絨毛刷狀緣,以氨基酸或肽的形式被吸收。研究表明,小肽能被完整地吸收,通過(guò)腸粘膜進(jìn)入血液循環(huán),微量元素利用氨基酸或肽的吸收機(jī)制,可以使吸收和循環(huán)進(jìn)入機(jī)體的效率更高。氨基酸與肽螯合物既是機(jī)體吸收金屬離子的主要形式,又是動(dòng)物體內(nèi)合成蛋白過(guò)程中的中間物質(zhì),因此,而且可以減少許多生化過(guò)程,節(jié)約能量消耗,具有較高的生物學(xué)效價(jià)[2]。 微量元素的代謝受穩(wěn)衡機(jī)制調(diào)控。研究表明,穩(wěn)衡調(diào)控在吸收、尿中排出、向腸腔的分泌、同紅細(xì)胞的交換、從肌肉中釋放幾個(gè)位點(diǎn)。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為,腸道是微量元素穩(wěn)衡調(diào)控的主要場(chǎng)所,吸收與內(nèi)源分泌是機(jī)體穩(wěn)衡調(diào)控的主要方式。當(dāng)日糧供給水平較低時(shí),吸收增加,排泄減少。排泄主要經(jīng)糞便。糞便中除來(lái)源于日糧中未吸收部分之外,還有相當(dāng)部分來(lái)自于唾液、肝臟、胰臟、腸粘膜細(xì)胞等向腸腔的內(nèi)源分泌。機(jī)體攝入量大時(shí),肝臟、胰臟向小腸分泌的增加,從而使內(nèi)源排出增多,以達(dá)到調(diào)節(jié)營(yíng)養(yǎng)的平衡。如鋅轉(zhuǎn)運(yùn)載體蛋白-1(zinc transporter,ZnT)在十二脂腸和空腸基底膜細(xì)胞中廣泛存在,ZnT-1主要位于質(zhì)膜,承載鋅向細(xì)胞外運(yùn)輸?shù)淖饔?,以消除鋅過(guò)量可能導(dǎo)致的潛在毒性。ZnT-2在小腸、腎臟、胎盤(pán)、肝臟中表達(dá)較多,其將鋅從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)涵體或溶酶體。ZnT-3主要在腦、睪丸中表達(dá),它將胞內(nèi)鋅轉(zhuǎn)運(yùn)入囊泡。ZnT-4主要存于乳腺和質(zhì)膜,胞內(nèi)鋅轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入囊泡。在生理?xiàng)l件下,鋅載體的表達(dá)與飼糧鋅濃度有密切的關(guān)系。另外,還有一種(divalent cation transporter,DCT)載體,主要在十二脂腸、空腸、腎、骨髓中表達(dá);其主要功能是作為鋅載體。當(dāng)機(jī)體鋅缺乏時(shí),加強(qiáng)鋅的轉(zhuǎn)運(yùn),從而增加吸收。用半定量RT-PCR法測(cè)定小腸ZnT1、ZnT4、DCT1、。結(jié)果表明,Zn-Met、ZnSO4處理顯著降低ZnT1、ZnT4、DCT1 mRNA表達(dá)量(P<0.05);Zn-Met組ZnT1、DCT1 mRNA表達(dá)量均顯著低于ZnSO4組(P<0.05);兩種鋅處理間ZnT4 mRNA表達(dá)量無(wú)明顯差異(P>0.05),另外肽載體表達(dá)增強(qiáng)。這些結(jié)果表明,氨基酸螯合物吸收更快,使ZnT1、ZnT4及DCT1 mRNA表達(dá)快速下降,減少腸道中鋅的吸收,從而維持鋅的內(nèi)穩(wěn)態(tài);動(dòng)物機(jī)體內(nèi)金屬硫蛋白(metallothionein,MT)合成與日糧微量元素?cái)z入量有關(guān)。禁食或飼喂高鋅的小鼠腸粘膜細(xì)胞中金屬硫蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng);但在常規(guī)劑量的鋅條件下,MT沒(méi)有明顯變化。小腸及肝臟MT-1 mRNA表達(dá)顯示MT促進(jìn)腸道對(duì)鋅的吸收和在粘膜細(xì)胞中滯留。細(xì)胞內(nèi)游離鋅濃度上升時(shí),細(xì)胞MT合成增加,其與游離鋅螯合;相反,鋅濃度下降時(shí),MT合成及穩(wěn)定水平下降,結(jié)合在MT中的鋅數(shù)量下降。鋅與MT結(jié)合的生物學(xué)效率受細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)影響。在小鼠肝臟、小腸MT-1 mRNA表達(dá)量,均為Control<ZnSO4<Zn-Met(P<0.05)。蛋氨酸鋅的轉(zhuǎn)運(yùn)效率明顯高于硫酸鋅,兩者轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制可能不同。由于無(wú)機(jī)鹽與氨基酸(肽)螯合物轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制不同,添加兩種微量元素更能夠加速吸收與利用。 3 微量元素氨基酸螯合物與機(jī)體氧化還原狀態(tài) 消化道自由基的生成與微量元素的形式和濃度有關(guān)。微量元素螯合物由于其特殊的結(jié)構(gòu),具有較好的化學(xué)穩(wěn)定性,分子內(nèi)電荷趨于穩(wěn)定,防止由于金屬離子如鐵、銅、鋅二價(jià)離子誘發(fā)的自由基生成等作用,防止無(wú)機(jī)微量元素鐵誘導(dǎo)產(chǎn)生的氧化損傷作用。無(wú)機(jī)鹽金屬離子如鐵,作為變價(jià)元素,2~3價(jià)互換,催化H2O2形成OH..。同時(shí),一些氨基酸、肽如蛋氨酸等配體本身具有清除自由基的能力, 從而影響腸粘膜細(xì)胞的功能、增殖、分化。 微量元素的缺乏或利用不良,影響過(guò)抗氧化酶的活性,將導(dǎo)致氧化還原等代謝過(guò)程紊亂,導(dǎo)致能量物質(zhì)趨向于流失或脂肪細(xì)胞,影響生長(zhǎng)發(fā)育甚至發(fā)生貧血等疾病。高濃度的一些微量元素會(huì)誘發(fā)氧化應(yīng)激,導(dǎo)致腸粘膜損傷,同時(shí)隨著微量元素濃度的提高,吸收效率降低。無(wú)極微量元素更易誘導(dǎo)H2O2生成羥自由基,具有潛在毒性,可引起細(xì)胞損害。同時(shí),一定濃度的自由基可誘導(dǎo)胃、十二指腸以及胰腺分泌生長(zhǎng)抑素(SS)表達(dá)與分泌,減緩胃腸道食糜通過(guò)速度,抑制胃泌素等腸道激素以及消化液與酶的分泌,降低ATP酶偶聯(lián)的轉(zhuǎn)運(yùn)載體的功能,減緩營(yíng)養(yǎng)素的吸收,總的效應(yīng)是減少游離基的生成,保護(hù)腸道粘膜細(xì)胞,但降低生長(zhǎng)速度。許多微量元素本身有參與抗氧化酶體系的作用,如鐵、銅、錳、鋅、硒等。微量元素缺乏在一定程度上造成了小鼠的氧化損傷,會(huì)顯著提高血清MDA含量。如補(bǔ)鋅使之明顯下降(P<0.05)。有機(jī)、無(wú)機(jī)鋅源均顯著提高AKP、GSH-Px活性、T-AOC、T-SOD、CuZn-SOD(P<0.05),而Zn-Met組T-AOC、T-SOD顯著高于ZnSO4組(P<0.05)。添加鋅顯著降低NO含量(P<0.05),Zn-Met效果顯著強(qiáng)于ZnSO4(P<0.05)。說(shuō)明兩種鋅源均能提高機(jī)體的抗氧化能力,而Zn-Met效果強(qiáng)于ZnSO4。 有機(jī)微量元素能夠調(diào)節(jié)消化道氧化還原狀態(tài),影響生長(zhǎng)軸激素的分泌。鋅對(duì)維持機(jī)體正常生長(zhǎng)具有重要作用,它對(duì)生長(zhǎng)激素(GH)、胰島素樣生長(zhǎng)因子I(IGF-I)、性腺激素等都有重要的影響。一般認(rèn)為,GH通過(guò)誘導(dǎo)合成IGF,尤其IGF-I而發(fā)揮作用。IGF-I可以降低機(jī)體組織的分解代謝,刺激細(xì)胞分裂、骨骼生長(zhǎng)、蛋白質(zhì)合成等。鋅缺乏時(shí)會(huì)降低GH mRNA基因表達(dá)、機(jī)體GH水平或損害GH 與其受體間的結(jié)合,降低IGF-I、GHR基因表達(dá)量,從減緩動(dòng)物生長(zhǎng)[3]。鋅對(duì)維持機(jī)體正常生長(zhǎng)具有重要作用,它對(duì)生長(zhǎng)激素(GH)、胰島素樣生長(zhǎng)因子I(IGF-I)、性腺激素等都有重要的影響。補(bǔ)鋅均能顯著提高IGF-I基因表達(dá)水平(P<0.05),與ZnSO4相比,Zn-Met更大幅度地提高IGF-I mRNA表達(dá)(P<0.05),從而有效地促進(jìn)小鼠生長(zhǎng)(P<0.05)[4]。 有機(jī)微量元素能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化還原狀態(tài),從而影響細(xì)胞增殖、凋亡的細(xì)胞過(guò)程。采用地噻咪松作為氧化應(yīng)激的誘導(dǎo)劑建立小鼠胸腺細(xì)胞凋亡模型;培養(yǎng)基中分別補(bǔ)加0、50、100、500、1000μM ZnSO4或Zn-Met,培養(yǎng)16小時(shí);測(cè)定細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度、DNA片段化等指標(biāo)[5]。結(jié)果表明,地噻咪松處理使自由基增加,細(xì)胞活力顯著下降,加鋅使之得到有效恢復(fù);Zn-Met處理的細(xì)胞活力高于同劑量ZnSO4處理。兩種鋅源對(duì)地噻咪松誘導(dǎo)的胸腺凋亡均有抑制作用,且這種抑制作用具有劑量效應(yīng)。50、100、1000μM添加水平時(shí),Zn-Met對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制作用低于ZnSO4(P<0.05);500μM時(shí),兩種鋅源對(duì)凋亡的抑制作用相近(P>0.05)。氧化應(yīng)激時(shí),鈣離子細(xì)胞內(nèi)流,隨鋅補(bǔ)加水平升高時(shí),細(xì)胞培養(yǎng)上清液及胞內(nèi)GSH-Px、CuZn-SOD活性隨之增高;而胞內(nèi)鈣濃度隨鋅添加水平增加顯著降低(P<0.05);Zn-Met對(duì)鈣離子濃度升高的抑制作用弱于同劑量ZnSO4(P<0.05)。Zn-Met提高細(xì)胞抗氧化的能力較強(qiáng)。細(xì)胞培養(yǎng)上清液中AKP活性隨鋅添加水平增加呈上升趨勢(shì);當(dāng)添加劑量為1000µM時(shí),Zn-Met處理組顯著高于ZnSO4處理(P<0.05)。上述結(jié)果表明,兩種鋅源均能抑制地噻咪松體外誘導(dǎo)的胸腺細(xì)胞凋亡,其機(jī)制涉及細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度、氧化還原狀態(tài)的變化等生理生化過(guò)程。有機(jī)鋅有助于改善氧化還原狀態(tài),影響消化道、免疫器官細(xì)胞的增殖、分化,影響消化液、酶的分泌等[6]。氨基酸微量元素螯合物的特性決定了緩解應(yīng)激,防止氧化應(yīng)激對(duì)機(jī)體的損傷從而提高生產(chǎn)性能。 4 微量元素氨基酸螯合物促生長(zhǎng)作用 微量元素氨基酸螯合物具有促生長(zhǎng)作用。微量元素氨基酸螯合物生物學(xué)利用率高于無(wú)機(jī)鋅,能有效促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)。飼喂玉米淀粉—酪蛋白半純合基礎(chǔ)日糧,添加硫酸鋅和蛋氨酸鋅日糧,結(jié)果表明,在飼養(yǎng)前期蛋氨酸鋅促長(zhǎng)效果優(yōu)于硫酸鋅(P<0.05)。盡管兩種鋅源對(duì)GH水平、GHR基因表達(dá)無(wú)顯著影響(P>0.05);均能提高肝臟、血清鋅含量及血清AKP活性;蛋氨酸鋅處理組織鋅含量增加幅度略高于硫酸鋅處理(P>0.05)。但Zn-Met顯著提高IGF-I mRNA表達(dá)(P<0.05),從而有效地促進(jìn)小鼠生長(zhǎng)(P<0.05)[7]。基因芯片的結(jié)果顯示,與硫酸亞鐵相比,蛋氨酸螯合鐵組肝組織珠蛋白與轉(zhuǎn)鐵蛋白合成相關(guān)基因,以及膽固醇、蛋白質(zhì)、ATP、脂肪合成相關(guān)基因明顯上調(diào)[8],表明微量元素氨基酸螯合物通過(guò)調(diào)節(jié)物質(zhì)代謝影響生長(zhǎng)。 在豬生產(chǎn)中的應(yīng)用仔豬仔豬日糧中添加氨基酸微量元素螯合物能促豬生長(zhǎng),提高飼料利用率。給28日齡的斷奶仔豬分別飼喂30天氨基酸微量元素螯合物與無(wú)機(jī)鹽日糧,結(jié)果表明,仔豬平均日增重提高8.3%,飼料效率提高8.1%。以35日齡斷奶仔豬為試驗(yàn)對(duì)象,試驗(yàn)組飼料中添加0.04%的蛋氨酸鐵螯合物,對(duì)照組飼料中不添加蛋氨酸鐵螯合物。經(jīng)過(guò)30天的飼養(yǎng)試驗(yàn),結(jié)果表明:試驗(yàn)組的日增重比對(duì)照組多增重77克,提高了25.4%,差異極顯著(P﹤0.01);試驗(yàn)組的平均采食量比對(duì)照組增加92克,提高了19.5%;試驗(yàn)組的料重比比對(duì)照降低4.5%。在乳豬開(kāi)料分別添加蛋氨酸鐵(100毫克/千克)和硫酸亞鐵2.5克/千克)進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn),試驗(yàn)組21日齡斷奶平均增重極顯著地高于對(duì)照組(P﹤0.01);試驗(yàn)組育成率比對(duì)照組提高8.3%;試驗(yàn)組的白痢發(fā)病率比對(duì)照組降低13.88%。因此,氨基酸微量元素螯合物更有效地改善斷奶仔豬的生產(chǎn)性能,明顯提高哺乳仔豬斷奶窩重和斷奶成活率。 生長(zhǎng)育肥豬在肥育豬日糧中添加氨基酸微量元素螯合物,可以提高增重,提高飼料報(bào)酬。研究表明,蛋氨酸鐵組比硫酸亞鐵組生長(zhǎng)豬日增重提高9.56%(P<0.05),采食量提高1.88%(P>0.05),飼料報(bào)酬提高7.09%(P<0.05),血紅蛋白含量提高2.37。以部分螯合物形式的鐵鋅和輕基蛋氨酸鐵分別替代無(wú)機(jī)鹽,平均日增重分別提高2.8%和8.3%,降低料肉比4.1%和13.7%。據(jù)報(bào)道,在日糧中添加氨基酸微量元素螯合物,在不增加采食量的情況下,試驗(yàn)組全期平均日增重較對(duì)照組高6.4%,改善飼料效率6.9%,與對(duì)照組比較差異顯著。使用氨基酸微量元素螯合物的投入產(chǎn)出比為1:19。 在雞生產(chǎn)中的應(yīng)用蛋雞在蛋雞的日糧中添加氨基酸微量元素螯合物能有效提高產(chǎn)蛋性能,改善蛋殼質(zhì)量。國(guó)外研究發(fā)現(xiàn),對(duì)飼喂氨基酸微量元素螯合物的產(chǎn)蛋雞的雞蛋成分進(jìn)行分析,蛋殼礦物質(zhì)元素的組分比例同對(duì)照組發(fā)生了較大的變化,蛋殼的結(jié)構(gòu)比無(wú)機(jī)組緊密,蛋黃中微量元素的含量高于無(wú)機(jī)組。用微量元素蛋氨酸螯合物飼喂42周齡的海蘭W-36蛋雞,結(jié)果在營(yíng)養(yǎng)等價(jià)的日糧條件下,以螯合物形式提供微量元素和蛋氨酸的試驗(yàn)組比等量補(bǔ)加無(wú)機(jī)鹽和蛋氨酸的對(duì)照組,其產(chǎn)蛋率、飼料效率和綜合經(jīng)濟(jì)效益分別提高了4.2%、4.37%、2.2%、2.2%。在蛋雞日糧中添加0.1克/千克的蛋氨酸銅,蛋雞的產(chǎn)蛋量和蛋殼的硬度顯著上升,軟殼蛋的比例和蛋重下降。還有飼喂試驗(yàn)證明,給蛋雞飼喂復(fù)合氨基酸微量元素螯合物,比飼喂無(wú)機(jī)鹽增加產(chǎn)蛋率7%,料蛋比降低7%以上,死亡率、破蛋率減少8%~40%,產(chǎn)蛋高峰期延長(zhǎng),雞蛋質(zhì)量提高,蛋黃微量元素含量增加10%以上。 5 微量元素氨基酸螯合物對(duì)機(jī)體免疫功能的影響 有機(jī)微量元素能夠調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力,提高抗病及抗應(yīng)激能力。微量元素氨基酸螯合物可減少吸收過(guò)程自由基的形成,能夠增強(qiáng)殺菌能力,提高免疫反應(yīng),提高動(dòng)物機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng),發(fā)揮抗病、抗應(yīng)激作用[9],如有機(jī)鋅絡(luò)合物可有效地治療豬增生性腸炎,氨基酸螯合銅與抗生素有協(xié)同作用。在21日齡斷奶小鼠,隨機(jī)分為三組(對(duì)照組,硫酸鋅組和蛋氨酸組);測(cè)定臟器指數(shù)、酸性α-萘酯酶染色陽(yáng)性率(ANAE+)、IL-1、IL-2、血清溶血素、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率(SI)、IgA、IgG、IgM等免疫學(xué)指標(biāo);研究結(jié)果表明,基礎(chǔ)日糧中添加Zn-Met和ZnSO4均能有效改善小鼠免疫機(jī)能;與Control相比,兩種鋅源均能顯著提高胸腺指數(shù)、ANAE+、IL-2、SI、IgM、IgA、IgG(P<0.05);Zn-Met組顯著升高脾臟指數(shù)、IL-1、溶血素、血清球蛋白(P<0.05);Zn-Met組 ANAE+、IgA、IgG均優(yōu)于ZnSO4組。微量元素氨基酸螯合物促生長(zhǎng)作用可有效提高機(jī)體免疫能力,有機(jī)的效果優(yōu)于無(wú)機(jī)鹽。 在仔豬生后3天飼喂添加蛋氨酸鐵飼料,死亡率比飼喂添加硫酸亞鐵飼料降低30.4%。研究發(fā)現(xiàn)母豬、仔豬同時(shí)補(bǔ)飼氨基酸螯合鐵,極顯著提高了血清免疫球蛋白水平,顯著提高仔豬抗病能力,并明顯表現(xiàn)有協(xié)同增強(qiáng)免疫力的作用。給處于高溫環(huán)境中的豬補(bǔ)充300微克/千克吡啶羧酸鉻4周,具有緩解高溫應(yīng)激作用,提高日采食量3.9%,日增重提高16.7%(P<0.05),料肉比下降12.2%(P<0.05)。增強(qiáng)免疫力,提高抗病能力。 6 結(jié)語(yǔ) 氨基酸微量元素螯合物對(duì)增加豬禽的采食量,提高生長(zhǎng)速度和繁殖力,改善產(chǎn)品品質(zhì)和機(jī)體的免疫功能等均有不同程度的促進(jìn)作用,無(wú)論從提高豬禽生產(chǎn)的效益,還是從環(huán)境保護(hù)角度來(lái)講,以氨基酸(肽)微量元素螯合物作為豬禽日糧添加劑,具有廣泛的應(yīng)用前景。深入研究適合機(jī)體的最佳螯合物結(jié)構(gòu)形式、作用機(jī)制、最佳添加比例及劑量,以降低飼養(yǎng)成本,達(dá)到最佳的經(jīng)濟(jì)效益。 參考文獻(xiàn)
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