化驗(yàn)工作方法的驗(yàn)證

yutaosl

檢定方法的驗(yàn)證
一個(gè)實(shí)驗(yàn)室在建立一個(gè)新方法或第一次使用一個(gè)新方法時(shí)，都要對該方法的適
用性和可靠性進(jìn)行測定，這就是驗(yàn)證。驗(yàn)證就是證明某一程序、生產(chǎn)過程、設(shè)備、
物料、活動或系統(tǒng)確實(shí)能達(dá)到預(yù)期結(jié)果的有文件證明的一系列活動(1)。WHO 在1992
年的GMP 中對驗(yàn)證的定義是能證明任何程序、工藝、設(shè)備、物料、活動、或系統(tǒng)確
實(shí)能導(dǎo)致預(yù)期結(jié)果的文件證明的行為（2，3）。
在我國GMP 文件中明確指出，藥品生產(chǎn)驗(yàn)證包括廠房、設(shè)施及設(shè)備安裝確認(rèn)、
運(yùn)行確認(rèn)、性能確認(rèn)和產(chǎn)品驗(yàn)證。因此，在使用前均應(yīng)對檢定方法、儀器、設(shè)施
系
統(tǒng)（如：空氣、水、蒸汽）、工藝（如：生產(chǎn)工藝、清掃、滅菌、無菌分裝、凍
干）
等進(jìn)行驗(yàn)證。對于部分和整體的驗(yàn)證的要求是不同的，如對于凍干機(jī)的驗(yàn)證和凍
干
過程的驗(yàn)證是不同的；清掃玻璃器皿和清掃設(shè)施的驗(yàn)證也是不一樣的；對滅菌過
程
和無菌試驗(yàn)也要采用不同的驗(yàn)證要求。對于一個(gè)過程來講，對其中每一部分的驗(yàn)
證
應(yīng)不同，如一個(gè)試驗(yàn)、試驗(yàn)中的試劑和儀器的驗(yàn)證要求是不同的。
一、 驗(yàn)證的分類
一般根據(jù)產(chǎn)品和工藝、方法的要求以及設(shè)備變更、工藝修訂等特點(diǎn)可以把驗(yàn)證
分為4 種類型。
1.前瞻性驗(yàn)證：
前瞻性驗(yàn)證就是在方法正式投入使用前按照預(yù)定的方案進(jìn)行研究，來收集實(shí)驗(yàn)
數(shù)據(jù)，以證實(shí)檢定方法達(dá)到預(yù)期要求的行為。該驗(yàn)證方法是一種最好和常用的驗(yàn)
證
方法。
2.同步驗(yàn)證：
就是已經(jīng)在生產(chǎn)中實(shí)施的某項(xiàng)工藝運(yùn)行中同時(shí)進(jìn)行的驗(yàn)證。在這種情況下驗(yàn)證
數(shù)據(jù)的收集來源于工藝的實(shí)際運(yùn)行過程中，一般要通過幾次運(yùn)轉(zhuǎn)才能獲得足夠的
數(shù)
據(jù)來證明工藝的可靠性。采用這種驗(yàn)證方式的先決條件是：
- 有完善取樣計(jì)劃，即生產(chǎn)及工藝條件的監(jiān)控比較充分；
- 有經(jīng)過驗(yàn)證的檢定方法，方法的靈敏性及特異性/選擇性比較好；
- 對所驗(yàn)證的產(chǎn)品或工藝已經(jīng)有相當(dāng)?shù)慕?jīng)驗(yàn)及把握。
3.回顧性驗(yàn)證：
如果某一產(chǎn)品已經(jīng)生產(chǎn)了很長一段時(shí)間，但沒有按照前瞻性驗(yàn)證的要求進(jìn)行過
驗(yàn)證，而又不能進(jìn)行同步驗(yàn)證（如儲備的原液可以使用幾年或設(shè)備正用于其他的
用
途），此時(shí)可以采用回顧性驗(yàn)證。通過對產(chǎn)品、生產(chǎn)步驟和檢驗(yàn)步驟進(jìn)行檢測和
分析，
以證明生產(chǎn)步驟和生產(chǎn)工藝的一致性和完整性。一般不采用這種驗(yàn)證方式。對于
檢
定方法，如果有足夠的數(shù)據(jù)也可以采用這種驗(yàn)證方式。
4.再驗(yàn)證：
當(dāng)影響產(chǎn)品質(zhì)量的主要因素，如工藝、質(zhì)量控制方法、主要原輔料、主要生產(chǎn)
設(shè)備等發(fā)生改變時(shí)，以及生產(chǎn)一定周期后，應(yīng)進(jìn)行再驗(yàn)證。它是旨在證實(shí)已驗(yàn)證
狀
態(tài)沒有發(fā)生漂移，表明該工藝仍能達(dá)到預(yù)定的要求。
一旦一個(gè)系統(tǒng)或一個(gè)工藝得到了驗(yàn)證，在操作過程未發(fā)生改變時(shí)，則認(rèn)為達(dá)到
了原定的要求。當(dāng)發(fā)生改變、或出現(xiàn)錯(cuò)誤、或更換設(shè)備或設(shè)備位置發(fā)生改變時(shí)，
則
需要進(jìn)行再驗(yàn)證。
驗(yàn)證分三個(gè)級別(1)除建立方法的實(shí)驗(yàn)室外還有二個(gè)或二個(gè)以上的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行驗(yàn)
證；(2)除建立方法的實(shí)驗(yàn)室外還有一個(gè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行驗(yàn)證；(3)只有建立方法的實(shí)
驗(yàn)室
進(jìn)行驗(yàn)證。理論上講所有的方法都應(yīng)進(jìn)行協(xié)作研究的驗(yàn)證，雖然做起來非常困難，
一般情況下也沒有這樣做，然而應(yīng)朝這一方向努力。對于一個(gè)方法只需進(jìn)行一次
驗(yàn)
證，如果對方法進(jìn)行了修改或擴(kuò)大了應(yīng)用范圍，都需要進(jìn)行再一次的驗(yàn)證。
若采用體外法來代替體內(nèi)的效力試驗(yàn)，則需要在一開始驗(yàn)證時(shí)就應(yīng)測定一個(gè)低
效價(jià)的疫苗，以便在早期就確定此新方法可以區(qū)別合格的和合格線以下的制品。
驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)也要證明在最差狀態(tài)下操作時(shí)，系統(tǒng)仍能達(dá)到原預(yù)定要求。
二、檢定方法的驗(yàn)證
檢定方法的驗(yàn)證就是根據(jù)方法的需要測定該方法的準(zhǔn)確性、精密性、直線性、
測定范圍、測定限度、測量限度、特異性和耐用性（或可靠性）等幾個(gè)指標(biāo)中的
一
個(gè)或幾個(gè)(4)。對于理化測定方法已有了確定的要求和判定標(biāo)準(zhǔn)（5-10），而生
物學(xué)
測定的結(jié)果具有更大的可變性，一般要使用動物或細(xì)胞，這些有機(jī)體本身就具有
較
大的可變性，因此生物學(xué)測定的要求和合格標(biāo)準(zhǔn)要松一些。
1．檢定方法的種類
測定生物制品的方法一般可分為三大類，即結(jié)合試驗(yàn)、細(xì)胞測定試驗(yàn)和動物試
驗(yàn)，對某些復(fù)雜的方法同時(shí)需要以上二種類型的測定方法。
1）、結(jié)合試驗(yàn)：
是指包括2 個(gè)或多個(gè)分子間結(jié)合的實(shí)驗(yàn)。免疫結(jié)合即是一例，結(jié)合試驗(yàn)一般用
于純化過程的監(jiān)測或清潔的驗(yàn)證試驗(yàn)。由于在結(jié)合試驗(yàn)中測定的分子不一定都是
具
有生物活性的分子，所以它一般不用作制品的效力測定。一般講結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果的
變
化在5～20%間。
2）、細(xì)胞測定試驗(yàn)：
是指制品可以誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生可測定的應(yīng)答，如細(xì)胞聚集、裂解、融合或產(chǎn)生特
異的化學(xué)物質(zhì)。細(xì)胞測定試驗(yàn)比結(jié)合試驗(yàn)具有更大的可變性，因此應(yīng)精心操作以
保
證試驗(yàn)結(jié)果的一致性。細(xì)胞測定常用于制品的效力測定。一般講細(xì)胞測定結(jié)果的
變
化在50%以上。
3）、動物試驗(yàn)：
更復(fù)雜并且包括飼養(yǎng)、管理和操作動物。它需要時(shí)間長并且具有更大的可變性，
一般測定一個(gè)藥物的生物活性是通過與已知的標(biāo)準(zhǔn)品或未處理（未免疫）的動物
進(jìn)
行比較而得。一般用于熱原質(zhì)、一般安全試驗(yàn)和效力試驗(yàn)。由于試驗(yàn)成本高，使
用
動物數(shù)目多費(fèi)時(shí)和可變性大，因此動物效力試驗(yàn)一般用于成品簽發(fā)時(shí)的測定。一
般
講動物測定結(jié)果的變化在50%以上。
在驗(yàn)證過程中，應(yīng)根據(jù)試驗(yàn)用途來確定驗(yàn)證哪些參數(shù)。WHO 和一些管理部門及
藥典已經(jīng)出版子許多關(guān)于分析方法驗(yàn)證的一些要求（4-10）。
一般國家檢定實(shí)驗(yàn)室使用的檢定方法分為以下4 種。
1)、標(biāo)準(zhǔn)方法：
是指已經(jīng)被多家實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了廣泛的研究，盡管某些方法可能是一個(gè)比較老的
方法，但一般認(rèn)為是最佳的實(shí)驗(yàn)方法。這類方法都進(jìn)行了徹底的研究和驗(yàn)證。
2)、正式的方法：
是指政府部門或國際組織（WHO、國家管理當(dāng)局或藥典）要求國家檢定實(shí)驗(yàn)室
使用的方法，這些方法在被確定為正式方法以前，也經(jīng)過了適當(dāng)?shù)尿?yàn)證。
3)、來自參考文獻(xiàn)的方法：
是指在專業(yè)雜志上發(fā)表并介紹的方法，一般要認(rèn)真對待這類方法，并需要進(jìn)行
徹底的驗(yàn)證。
4)、自己建立的方法：
是指為了提高檢測方法或?yàn)榱诉_(dá)到某一特定要求而開發(fā)的或?qū)υ椒ㄟM(jìn)行了修
改的方法，這類方法需要進(jìn)行嚴(yán)格的驗(yàn)證。
如果某實(shí)驗(yàn)室需要采用已經(jīng)過徹底驗(yàn)證的標(biāo)準(zhǔn)方法和正式方法，在第一次應(yīng)用
前需要進(jìn)行驗(yàn)證以證時(shí)實(shí)驗(yàn)操作達(dá)到了要求。如果采用新開發(fā)的或修改了的方法
作
為常規(guī)檢定方法，除需要進(jìn)行一系列的驗(yàn)證外，同時(shí)還應(yīng)考慮以下幾個(gè)問題：
(1)該方法是否達(dá)到了特定的要求？
(2)該方法的靈敏性、重復(fù)性、準(zhǔn)確性和精密性方面是否達(dá)到了要求？
(3)該方法在技術(shù)上是否要求很苛刻？
(4)實(shí)驗(yàn)室是否具有應(yīng)用該方法的專業(yè)知識？是否需要培訓(xùn)？
(5)該方法是否需要特殊的設(shè)備？
(6)該方法是否造價(jià)很高？
(7)該方法是否需要時(shí)間過長？
2．驗(yàn)證時(shí)應(yīng)考慮的問題
首行要確定方法的適用性，該方法首先可以得到可重復(fù)的、可信的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，
要考慮在以下幾個(gè)參數(shù)：準(zhǔn)確性、精確性、靈敏性、特異性和耐用性（可靠性）。
第
二，要與已知的方法進(jìn)行對比試驗(yàn)，以考查二者間的相互關(guān)系。
如果在該實(shí)驗(yàn)室內(nèi)無可對比的老方法，則首先建立標(biāo)準(zhǔn)的方法，用含一定范圍
濃度的樣品進(jìn)行測定，以標(biāo)準(zhǔn)方法所得結(jié)果作為標(biāo)準(zhǔn)，用統(tǒng)計(jì)學(xué)的方法進(jìn)行對比
處
理，得出二種方法間的相關(guān)系數(shù)。對于一個(gè)新建立的方法則需要進(jìn)行協(xié)作研究對
其
適用性進(jìn)行驗(yàn)證。
3．驗(yàn)證中需測定的參數(shù)
驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中需對以下幾個(gè)參數(shù)進(jìn)行測定。
1）、準(zhǔn)確性（accuracy）
表示測定值與真實(shí)值之間的一致性或接近的程度。一般采用填加和回收試驗(yàn)來
測定準(zhǔn)確性，即將已知量的樣品加到空白中進(jìn)行測定，比較測定值與真實(shí)值之比。
準(zhǔn)確性一般表示為偏差（bias）或測定值與真值之間的錯(cuò)誤率（回收率）（即測
定值
/真實(shí)值×100%）。一般對于生物制品而言，因?yàn)闆]有純的標(biāo)準(zhǔn)品，所以準(zhǔn)確性
不太
實(shí)用。生物制品測定時(shí)一般與同時(shí)進(jìn)行的參考品進(jìn)行比較而得，此時(shí)的合格標(biāo)準(zhǔn)
一
般是測定出的參考品值的合格范圍或樣品與參考品之間的比值。
2）、精密性（precision）
表示測定值之間的一致性或接近的程度，一般表示為變異系數(shù)(CV%)，變異系數(shù)
即是測定值的標(biāo)準(zhǔn)差與測定值的比值。精密性分幾種：一種是實(shí)驗(yàn)內(nèi)的精密性（即
重復(fù)性 repeatability），它是在同一次試驗(yàn)內(nèi)同一個(gè)樣品多次測定結(jié)果間的變
異系數(shù)。
另一種是實(shí)驗(yàn)間的精密性（或叫intermediate precision），它是在同一實(shí)驗(yàn)
室內(nèi)不同
次試驗(yàn)間對同一樣品多次測定結(jié)果間的變異系數(shù)。實(shí)驗(yàn)室之間的精密性即重現(xiàn)性
(reproducibility)，一般可通過協(xié)作研究得到，此參數(shù)不適合生產(chǎn)設(shè)施的驗(yàn)證。
3）、耐用性（robustness/ruggedness）
是通過有效地改變實(shí)驗(yàn)方法的參數(shù)，來測定此改變對試驗(yàn)結(jié)果的影響，即實(shí)驗(yàn)
結(jié)果不受影響的承受程度。參數(shù)的改變可以是室溫或培養(yǎng)溫度，或濕度、或改變
培
養(yǎng)時(shí)間，或?qū)υ噭┑膒H 進(jìn)行較小范圍的調(diào)整等。在每種試驗(yàn)條件下，對準(zhǔn)確性、
精密性、或其他參數(shù)進(jìn)行測定，以確定試驗(yàn)方法的耐受或承受能力。
4）、直線性（linearity）
是測定結(jié)果與樣品中測試物濃度的正相關(guān)性，該參數(shù)的測定將確定檢測方法的
測量范圍，它可以表示為回歸直線的斜率和離散性，或者相關(guān)系數(shù)R 和測定系數(shù)
R2 。
5）、測量范圍（Range）
是指當(dāng)準(zhǔn)確性和精密性都能達(dá)到要求時(shí)所能測得的樣品中待檢物的最高濃度，
它就是測定直線性的上限，如果劑量和反應(yīng)間的關(guān)系不成直線，測量范圍可以通
過
校正曲線來測得。
在《中華人民共和國藥典》中規(guī)定測量范圍是指能達(dá)到一定精密度、準(zhǔn)確性和
直線性，測定方法適用的高低限度或量的區(qū)間（11）。
6）、選擇性/特異性（Selectivity/Specificity）
是指當(dāng)檢測方法對測試樣品中含有制品中應(yīng)有的其他化合物時(shí)，測定待測物的
能力。本參數(shù)用于鑒別試驗(yàn)、濃度或效力試驗(yàn)和純度試驗(yàn)的測定，以確定使用該
檢
測方法所測定的結(jié)果是否準(zhǔn)確地反映了制品的鑒別、效價(jià)或純度。選擇性（特異
性），
就象準(zhǔn)確性一樣，一般用偏差或測定值與已知值之間的錯(cuò)誤率（%）來表示。
7）、測定限度（Limit of Detection）
是指能夠測定出的樣品中測試物的最低量。該量并不一定要定量測出其準(zhǔn)確的
含量或濃度，它是檢查限度實(shí)驗(yàn)中最重要的一個(gè)參數(shù)。
8）、測量限度（Limit of Quantitation）
是指在準(zhǔn)確性和精密性都能達(dá)到要求時(shí)能夠定量測定出的樣品中測試物的最低
量。LOQ 是檢查測定藥品中不純物方法的一個(gè)參數(shù)。
根據(jù)WHO 關(guān)于測定方法驗(yàn)證試驗(yàn)的文件，用于不同檢定目的的實(shí)驗(yàn)方法需進(jìn)
行不同參數(shù)的測定。下表給出了不同檢定方法需驗(yàn)證的參數(shù)。
不同測定方法應(yīng)進(jìn)行的驗(yàn)證的參數(shù)
雜質(zhì)檢查 參 數(shù) 鑒別試驗(yàn)
定量 限度
效價(jià)測定 組成測定
準(zhǔn)確性 + + +
精確性 + + +
耐用性 + + + + +
直線性和測定范圍 + + +
選擇性（特異性） + + + + +
測定限度 + +
測量限度 +
另外，由于生物測定的持續(xù)性、復(fù)雜性、以及參考品和樣品貯存時(shí)間較長的特
性，除了上述驗(yàn)證參數(shù)外，對于生物測定有另外幾個(gè)參數(shù)也非常重要，包括：
1)、試驗(yàn)順序（front-to-back test）的影響：它是測定在一個(gè)較復(fù)雜的試驗(yàn)中，
先測和后測對試驗(yàn)參數(shù)的影響。這是由于它們相對于對照品的測定時(shí)間不一樣而造
成的。
2)、凍融穩(wěn)定性的影響：將樣品反復(fù)凍融，以確定對測定結(jié)果的影響。
3）、批間的精密性：測定不同批細(xì)胞、血清、或其他具有較高變化性的物質(zhì)對
測定方法精確性的影響。
4．驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中參數(shù)測定的具體操作和要求
1）、準(zhǔn)確性：
對于某些尚無純品的生物測定來說可能不適用。對于某些已達(dá)到敏感性和特異
性要求的方法來說可以不測定該參數(shù)。下述方法只適用于免疫分析。
目的：確定該方法測量預(yù)定值的能力。
步驟：至少配制3 個(gè)不同濃度填加到空白中的測試物
每一濃度配制2 份樣品
每1 次試驗(yàn)對6 份樣品重復(fù)測定3 次
比較測定值和真實(shí)值
求出回收率（%），即偏差
2）、精密性
（1） 試驗(yàn)內(nèi)精密性
目的：確定在同一個(gè)試驗(yàn)內(nèi)同一個(gè)樣品在測量范圍內(nèi)的不同濃度時(shí)測定的精密
性。
步驟：配制3 個(gè)稀釋度的樣品（測量范圍內(nèi)的高、中、低濃度）
每一個(gè)稀釋度重復(fù)測定10 份（同一試驗(yàn)內(nèi)）
計(jì)算每一濃度測定結(jié)果的均值和SD
計(jì)算每一濃度的CV 值
（2） 試驗(yàn)間精密性
目的：確定在不同試驗(yàn)間對測量范圍內(nèi)同一個(gè)樣品在不同濃度時(shí)測定的精密性。
步驟：配制3 個(gè)稀釋度的樣品（測量范圍內(nèi)的高、中、低濃度）
在3 個(gè)試驗(yàn)中對每一個(gè)稀釋度重復(fù)測定3 份
測定不同工作日間的變化
測定不同批號的試驗(yàn)材料間的變化
測定不同實(shí)驗(yàn)員間的變化等等
計(jì)算每一試驗(yàn)中每一濃度測定結(jié)果的均值和SD
計(jì)算試驗(yàn)間每一濃度的CV 值
3）、測定限度
對于生物測定，LOD 就是產(chǎn)生始終如一的比空白對照強(qiáng)的反應(yīng)的最低濃度。產(chǎn)
生比空白對照高2-3 個(gè)SD 的反應(yīng)一般認(rèn)為是滿意的測定限度。下述步驟是以免疫測
定的OD 值作為例子。
目的：確定比空白對照高3 個(gè)SD 的值
步驟：配制一份適當(dāng)濃度樣品
配制一份不含樣品的空白對照液（0 濃度）
按照SOP 至少測定3 次，每次要重復(fù)2 孔
測定樣品和空白對照的OD 值
計(jì)算空白對照的SD 值
LOD=3×對照的SD 值/（樣品OD/樣品濃度）。
另外，在某些測定中采用2：1 或3：1 的信/噪比作為測定限度；若用標(biāo)準(zhǔn)誤來表
示則為3.3SD/b，其中SD 為標(biāo)準(zhǔn)誤，b 為對照樣品線性回歸的直線斜率。
測量限度采用10：1 的信/噪比；或10SD/b（12）。
4）、直線性和測定范圍
目的：測定觀測值的直線擬合度
步驟：在測量范圍內(nèi)配制6-8 個(gè)稀釋度
每一稀釋度測定3 次，每次重復(fù)測定3 份
計(jì)算每次試驗(yàn)的測定值、真值和回收率%
分析線性回歸并計(jì)算每次試驗(yàn)的相關(guān)系數(shù)R
另一種方法：
計(jì)算每一稀釋度的準(zhǔn)確性和精密性
測定范圍即是能夠得到滿意的準(zhǔn)確性和精密性的最高和最低濃度。
總之，生物制品的測定由于其生物測定的變異性，因此，不同的測定方法和反應(yīng)原
理時(shí)在驗(yàn)證中應(yīng)根據(jù)具體情況進(jìn)行不同參數(shù)的測定，有時(shí)還要對樣品凍融等因素對測定
結(jié)果的影響等等。在對測定方法的驗(yàn)證中主要應(yīng)對方法的適用性和可靠性進(jìn)行測定，以
確定該方法在本實(shí)驗(yàn)室內(nèi)能夠得到準(zhǔn)確和重復(fù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并且在測定范圍、測定限度
和特異性等方面達(dá)到了測定的要求，確保實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確與可靠。