O78型鴨大腸桿菌的分離鑒定及免疫試驗(yàn)

xiaomeng_024

取菌種，用滅菌接種環(huán)致密劃線于瓊脂平板表面，用無(wú)菌鑷子將各種抗菌藥物圓紙片分別貼于培養(yǎng)基表面，各片距離要相等37℃培養(yǎng)24小時(shí)觀察結(jié)果。

1.2.4
血清學(xué)鑒定

挑取麥康凱上的菌，以馬丁肉湯擴(kuò)大培養(yǎng)，121℃滅活30min,用禽源大腸桿菌O型單因子血清進(jìn)行平板凝集反應(yīng)。

毒力試驗(yàn)摘要：2008年從四川某鴨廠發(fā)生的以心包炎肝周炎為特征的病鴨群中分離獲得1株革蘭氏陰性桿菌，定名為SC-2008。經(jīng)分離培養(yǎng)、形態(tài)學(xué)檢查、生理生化試驗(yàn)、血清學(xué)鑒定、毒力實(shí)驗(yàn)，分離菌株被鑒定為O78型鴨大腸桿菌。用該菌株進(jìn)行液體培養(yǎng)制備的油乳劑滅活疫苗，可使鴨獲得較好的免疫力，能有效的預(yù)防本病的發(fā)生。

關(guān)鍵詞：鴨大腸桿菌；鑒定；免疫

大腸桿菌可引起鴨敗血性傳染病，病鴨病變特征為心包炎、肝周炎、氣囊炎等，近年隨著規(guī)?；B(yǎng)鴨業(yè)的不斷發(fā)展，鴨大腸桿菌病的發(fā)生有越來(lái)越嚴(yán)重的趨勢(shì)，成為目前危害養(yǎng)鴨業(yè)最嚴(yán)重的傳染病之一。

1材料與方法

1.1材料

培養(yǎng)基：麥康凱和改良馬丁，自制；病鴨來(lái)源：四川；生化反應(yīng)管：杭州微生物試劑有限公司

1.2方法

1.2.1
細(xì)菌學(xué)檢查

根據(jù)臨床癥狀、發(fā)病鴨剖檢，主要病理變化有心包炎、肝周炎、膽囊充盈、全身敗血癥。無(wú)菌采取該鴨的腦和肝臟，常規(guī)處理，在麥康凱和改良馬丁上劃線，放入37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，鏡檢后，挑選單個(gè)菌落,繼續(xù)劃線培養(yǎng)。挑取麥康凱平板上的單一菌落，按常規(guī)方法進(jìn)行革蘭氏染色。

1.2.2
生化試驗(yàn)

取細(xì)菌的純培養(yǎng)物分別接于微量發(fā)酵管，37℃培養(yǎng)24小時(shí)，觀察結(jié)果。

1.2.3
藥敏試驗(yàn)

1.2.5

1.2.5.1
半數(shù)致死量

將菌液稀釋至16×104CFU, 8×104CFU, 4×104CFU, 2×104CFU, 1×104CFU, 0.5×104CFU和 0.25×104CFU細(xì)菌，將19日齡肉鴨隨機(jī)分成8組，每組5只，分別于腿部肌肉攻毒1ml/只，生理鹽水設(shè)為對(duì)照組。

1.2.5.2
哺乳動(dòng)物接種試驗(yàn)

	小鼠	豚鼠	兔子
劑量	10億/只	100億/只	1000億/只
注射部位	腹腔	皮下	皮下
體重	30—35g	350—400g	1200—1500g

1.2.5.3
SPF雞接種試驗(yàn)

取15只21日齡SPF雞，隨機(jī)分成三組，將菌液稀釋成2.5×105CFU，1×106CFU，5×106CFU，肌肉注射，1 ml/只。

1.2.6
疫苗制備

1.2.6.1
菌液制備

將細(xì)菌接種到液體改良馬丁培養(yǎng)基，于37℃搖床培養(yǎng)7h，活菌計(jì)數(shù)，將菌液加入4‰的甲醛于37℃滅活24小時(shí)，將菌進(jìn)行無(wú)檢、安檢。

1.2.6.1
滅活疫苗的制備

取滅活后檢驗(yàn)合格的菌液加吐溫-80制成水相，與混合油相一起乳化制備滅活疫苗。

1.2.6.2
疫苗性狀測(cè)定

對(duì)制備的油乳劑滅活苗進(jìn)行物理性狀檢驗(yàn)、劑型試驗(yàn)、穩(wěn)定性試驗(yàn)、有效期測(cè)定等。

1.2.6.3
滅活疫苗效力檢驗(yàn)

用試制的疫苗皮下接種于5日齡健康易感肉鴨40只，0.3ml/只（含一個(gè)免疫劑量），于免疫后7d、10d、14d、28d，分別隨機(jī)選取10只攻毒，另選10只未免疫做空白對(duì)照，攻50倍半數(shù)致死量的量，計(jì)算保護(hù)率。

2結(jié)果

2.1
菌體形態(tài)

接種麥康凱培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)24小時(shí)，肉眼觀察為粉紅色，隆起，表面光滑邊緣整齊的S型菌落。代次間菌落大小，光滑度，隆起度，色澤度，邊緣整齊度肉眼看不出差別。涂片為革蘭氏陰性，兩端鈍圓的桿菌。

2.2
生化試驗(yàn)

鳥(niǎo)氨酸（+）、甘露糖（+）、甘露醇（+）、木糖（+）、阿拉伯糖（+）、果糖（+）、山梨糖（+）、鼠李糖（+）、半乳糖（+）、棉子糖（+）、麥芽糖（+）、葡萄糖（+）、乳糖（+）、山梨醇（+）、水楊素（—）、七葉苷（—）、枸櫞酸（—）、硫化氫（—）、蔗糖（—）、木糖醇（—）、衛(wèi)茅醇（—）、肌醇（—）、側(cè)金盞（—）、明膠22℃（—）、糊精（—）、尿素（—）。從結(jié)果上看100%符合大腸桿菌的生化特性。

2.3
藥敏試驗(yàn)

共做了38種藥敏片，主要是氨基糖苷類敏感，其余都有或多或少的耐藥性

有效果的主要為：

藥物種類	多粘菌素B	頭孢曲松	磷霉素	卡那霉素	新霉素
抑菌圈大小	1.1cm	2.0cm	1.65 cm	1.7cm	1.9cm
敏感度	中度敏感	中度敏感	敏感	中度敏感	敏感

2.4血清學(xué)鑒定

O78血清凝集為陽(yáng)性

2.5動(dòng)物攻毒

2.5.1半數(shù)致死量

經(jīng)計(jì)算：LD50=0.37萬(wàn)/只，MLD=4萬(wàn)/只

2.5.2哺乳動(dòng)物接種試驗(yàn)

攻毒16h小白鼠和豚鼠死亡，40h兔子死亡，兔子在攻毒16h體溫平均升高2℃，對(duì)照健存。均出現(xiàn)皮下出血，肝臟出血，腸道出血，水腫，膠凍樣，心臟冠狀出血，肺臟出血，胰臟出血，胃出血。取肝臟和心臟細(xì)菌分離，均分出大腸桿菌。

2.5.3 SPF雞接種試驗(yàn)

48小時(shí)均出現(xiàn)癥狀，注射1×106CFU，5×106CFU，雞在96小時(shí)發(fā)生死亡，對(duì)照正常，剖檢均有腿部肌肉出血，心包炎，肝周炎，腸道出血，肺臟出血，氣囊混濁膽囊充盈，取肝臟和心臟細(xì)菌分離，均分出大腸桿菌。

2.6疫苗制備

2.6.1疫苗性狀測(cè)定

該油苗為乳白色乳劑,劑型為油包水型。以3 000 r/min離心15 min,疫苗不出現(xiàn)分層現(xiàn)象；在

37℃左右條件下放置21 d，不破乳；2~8℃及室溫存放6個(gè)月，基本不出現(xiàn)分層現(xiàn)象。保存期測(cè)定，2~8℃冷藏保存，有效期為1年；粘度測(cè)定時(shí)間為3.6 s，適于注射。

2.6.2免疫產(chǎn)生期和免疫持續(xù)期試驗(yàn)

免疫7d保護(hù)率即達(dá)到100%保護(hù)，對(duì)照鴨全部死亡。到28d保護(hù)率未發(fā)生變化。

3討論

3.1對(duì)分離的細(xì)菌進(jìn)行形態(tài)觀察、生化試驗(yàn)及血清學(xué)鑒定為O78型大腸桿菌，據(jù)報(bào)道，與禽病有關(guān)的大腸桿菌最常見(jiàn)的是O1、O2、O35、O78等[1]。此株菌可用于制備流行株的疫苗。

3.2分離出大腸桿菌O78對(duì)鴨、雞、小白鼠、豚鼠和兔子具有較高的毒力，在生物學(xué)上應(yīng)引起重視。

3.3由于大腸桿菌帶有可傳導(dǎo)的抗藥性質(zhì)粒和菌株[2]，加上大腸桿菌病防治中，抗生素的普遍使用，使得大腸桿菌的耐藥譜越來(lái)越寬，，防治效果越來(lái)越差；此外，藥物防治的成本不斷提高，并造成鴨胴體內(nèi)藥物殘留而影響公共衛(wèi)生[3]。因此應(yīng)用藥物治療大腸桿菌病有一定的局限性。從結(jié)果可看出分離株的免疫原性很好，本試驗(yàn)制備的油乳劑滅活疫苗是針對(duì)某些地區(qū)的疫情而研制生產(chǎn)的，因而在使用過(guò)程中能在早期很快地形成群體免疫，具有針對(duì)性強(qiáng)、免疫期長(zhǎng)的特點(diǎn)，且在使用時(shí)不存在散毒問(wèn)題，安全、可靠。

3.4大腸桿菌是條件性致病菌，普遍存在于鴨群中，當(dāng)環(huán)境改變和抵抗力下降時(shí)容易發(fā)生此病。因此建議根據(jù)當(dāng)?shù)亓餍兄赀M(jìn)行針對(duì)性免疫，平時(shí)還需要加強(qiáng)環(huán)境管理，此為長(zhǎng)期預(yù)防大腸桿菌病的關(guān)鍵。

參考文獻(xiàn)：

[1]
宋立,寧易寶,張秀英,等.中國(guó)不同地區(qū)禽大腸桿菌血清型分布和耐藥性比較研究[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2005,38(7):1466-1473.

[2]
Van Den Bogaard , A E , N London , et al . Antibiotic resistance of faecal Escherichia coli in poultry , farmers and poultry slaughterers[J] . J Antimicrob Chermother , 2001 , 47 : 763-771.

[3]
Caya F , J M Fairbrother , L Lessard , et al . Characterization of the risk to human health of pathogenic Escherichia coli isolates from chicken carcasses [J] . J Food Prot , 1999 ,62 : 741-746.

[4] 李玲,汪銘書(shū),程安春,等.雛鴨致病性大腸桿菌的分離鑒定藥敏試驗(yàn)及耐藥分析[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志,2007,43(12):34-36.

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